鎘經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)雞肝細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、鎘是一種環(huán)境化學(xué)污染物，可通過水、空氣和土壤的污染在動(dòng)植物體內(nèi)蓄積，而肝臟是體內(nèi)最初鎘積累和產(chǎn)生毒性部位，鎘對(duì)動(dòng)物肝臟的毒性作用可引發(fā)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激已成為國外研究的熱門，但鎘對(duì)肝細(xì)胞損傷機(jī)制的研究較少，尤其是關(guān)于鎘致禽類肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡相關(guān)研究未見報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)克隆內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)基因，利用基因工程技術(shù)在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了GRP78蛋白并制備出了多

2、克隆抗體；而后以雞肝細(xì)胞為研究對(duì)象，在培養(yǎng)體系中分別加入終濃度0、2.5、5、10、20μmol/L氯化鎘(CdCl2)，作用24 h，通過對(duì)雞肝細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡、DNA損傷、細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度、GRP78蛋白表達(dá)量及GRP78、GRP94、CaM、Bak、Bcl-2和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平等方面的檢測，探討鎘致雞肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的機(jī)理。研究結(jié)果表明：
　　 1利用原核表達(dá)載體表達(dá)融合蛋白免疫新西蘭白兔，成

3、功制備出抗雞GRP78的多克隆抗體。
　　 2應(yīng)用MTT比色法首次測定了染鎘24h雞肝細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為15.59±0.89μmol/L，表明鎘對(duì)雞肝細(xì)胞有毒性作用；
　　 3倒置顯微鏡下觀察不同生長時(shí)期雞肝細(xì)胞生長情況，AO/EB雙熒光染色、DNA Ladder檢測不同濃度CdCl2對(duì)雞肝細(xì)胞的影響，結(jié)果證實(shí)CdCl2可誘導(dǎo)雞肝細(xì)胞發(fā)生凋亡，且凋亡具有劑量依賴性；
　　 4應(yīng)用Fura-3/AM熒

4、光指示劑測定染鎘后雞肝細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i升高，CaM基因mRNA表達(dá)量降低，鈣穩(wěn)態(tài)發(fā)生紊亂，證實(shí)鈣穩(wěn)態(tài)失衡在鎘致雞肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡中起作用。
　　 5 western bolt檢測GRP78蛋白表達(dá)量，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測GRP78和GRP94 mRNA表達(dá)量，結(jié)果證實(shí)GRP78蛋白表達(dá)量和mRNA表達(dá)量都隨染鎘劑量升高而增多，GRP94mRNA表達(dá)量也呈劑量效應(yīng)關(guān)系，證實(shí)GRP78和GRP94對(duì)肝細(xì)胞的應(yīng)激有保護(hù)作