PRRSV感染誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的分子機制研究.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是病毒蛋白折疊、裝配與成熟的場所，病毒感染細胞后常導致以未折疊蛋白大量積累為特征的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。發(fā)生應激后，為了維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)和功能，細胞隨即啟動未折疊蛋白反應(UPR)，通過抑制病毒蛋白的合成、降解駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的病毒蛋白量或誘導促折疊伴侶分子表達等,應對病毒感染導致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。而病毒為了達到在細胞內(nèi)有效復制與感染的目的，則通過對UPR的精細調(diào)控消除對其增殖的不利因素，營造有利于其復制與增殖的微環(huán)境，同時病毒還通過調(diào)控UPR抑制

2、干擾素(IFN)等天然抗病毒分子的表達，從而逃避機體的免疫抑制作用，最終達到致病的目的。
　　 豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起以妊娠母豬嚴重繁殖障礙以及仔豬呼吸道癥狀和高死亡率為特征的豬繁殖與呼吸綜合征，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，盡管在過去的20年間人們對PRRSV進行了廣泛的研究，取得了一系列有重要意義的結(jié)果，但仍難以揭開這種“神秘病”的神秘面紗，尤其在病毒的感染機制和免疫機理等基礎(chǔ)研究方面，人們還知之甚少。

3、鑒于UPR在病毒的感染與免疫逃避中的重要作用，本研究主要針對PRRSV感染后誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的分子機制進行了深入探討，以期進一步揭示PRRSV的感染與致病機理。主要研究內(nèi)容包括：
　　 1-PRRSV感染誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)PRRSV感染后的Marc-145細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生明顯的腫脹；同時利用SYBRReal-timeRT-PCR檢測PRRSV感染后不同時間內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的兩種標志分子GRP78和GRP94的表達

4、情況，也發(fā)現(xiàn)PRRSV感染能顯著上調(diào)伴侶分子GRP78和GRP94的表達，并呈時間依賴性。說明PRRSV感染后能誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應。
　　 2.PRRSV感染激活PERK途徑通過Westernblotting檢測PERK的直接作用底物elF2a的磷酸化，發(fā)現(xiàn)在PRRSV感染后6h就能檢測到磷酸化的eIF2a,36h達到最高水平，48h有所下降，而總的eIF2a蛋白含量沒有明顯變化。說明PRRSV感染早期就能通過磷酸化的elF2a

5、抑制蛋白的翻譯，激活PERK途徑。對elF2a下游分子檢測發(fā)現(xiàn)，當PRRSV持續(xù)感染，細胞不能通過UPR克服應激時，磷酸化的elF2a通過激活轉(zhuǎn)錄因子ATF4誘導下游基因CHOP和GADD34的表達上調(diào)，由CHOP基因介導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的細胞凋亡，同時由GADD34基因?qū)PR進行負反饋調(diào)節(jié)。
　　 3.PRRSV感染激活I(lǐng)REl/XBP1途徑RT-PCR和酶切檢測發(fā)現(xiàn)PRRSV感染Marc-145細胞后，IRE1的唯一作用底物XB

6、P1表達上調(diào)，且多以XBPls剪切形式存在。利用SYBRReal-timeRT-PCR和雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)，XBPls的靶基因如介導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解的蛋白EDEM和UPR負反饋調(diào)節(jié)蛋白p58lPK以及僅依賴于XBPls識別的UPRE元件在PRRSV感染后的Marc-145細胞中均有上調(diào)。說明PRRSV感染激活I(lǐng)REl/XBP1途徑。
　　 4.PRRSV感染不激活ATF6途徑利用熒光素酶報告基因檢測PRRSV感染Marc

7、-145細胞后不同時間轉(zhuǎn)錄活化因子ATF6的表達，發(fā)現(xiàn)其未被激活。進一步對其靶基因進行分析發(fā)現(xiàn)，能夠被ATF6識別的ERSE元件以及由ATF6誘導表達的一些重要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白PDI、ERp57、calnexin、calreticulin在PRRSV感染后的Marc-145細胞中均沒有顯著變化。說明PRRSV感染不激活ATF6途徑。
　　 5.PRRSVORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5編碼的蛋白參與UPR調(diào)控將

8、PRRSV各結(jié)構(gòu)蛋白基因的真核表達質(zhì)粒與熒光素酶報告質(zhì)粒XBPl-Fluc共轉(zhuǎn)染Hela細胞，通過對XBPls的熒光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn)PRRSVORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5編碼的蛋白可以誘導XBPls的表達，說明這幾個蛋白參與PRRSV誘導的UPR的調(diào)控。經(jīng)分析，這些蛋白都含有糖基化位點，而蛋白質(zhì)的糖基化抑制可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，因此我們推測，含有糖基化位點的蛋白更容易誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應。
　　 6.PRRS

9、V感染通過CHOP誘發(fā)細胞凋亡CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑的關(guān)鍵細胞因子，在證實PRRSV感染能夠誘導CHOP基因的表達后，對其誘導細胞凋亡的機制進行了進一步的研究，發(fā)現(xiàn)PRRSV感染后能上調(diào)凋亡標志基因caspase3,9的表達，而當CHOP的表達被siRNA抑制時，caspase3,9的表達也顯著下調(diào)，說明PRRSV感染能夠通過CHOP誘發(fā)細胞凋亡。對PRRSV在細胞中的增殖檢測發(fā)現(xiàn)，當CHOP基因被抑制后，PRRSV的增殖顯著增強，說