金黃色葡萄球菌激活中性粒細胞致血管滲漏機制研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌是引起感染的常見的病原菌，特別是社區(qū)相關性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（CA-MRSA）的出現，嚴重的威脅到人類的健康。CA-MRSA的輕微感染會引起皮膚或軟組織等定植感染，嚴重感染可引起比如膿毒癥、中毒性休克綜合征等。一些臨床癥狀顯示，在金葡菌引起的嚴重感染的前期伴隨有水腫、低血壓，血漿滲漏等現象，疾病后期則會演變?yōu)樾菘?、多器官衰竭等癥狀，這些現象表明在金葡菌感染的過程中存在重要的病理學變化-血管內皮屏障的損傷。
　　

2、文獻調研顯示，目前已報道的金葡菌感染引起內皮屏障通透性改變的主要毒力因子有四種：超抗原類蛋白、α-溶血素、殺白細胞素和半胱氨酸蛋白酶類，通過直接或間接作用于血管內皮細胞影響血管通透性。除此之外，一些臨床上的研究顯示仍有一些未知的作用機制。
　　在對膿毒癥的臨床研究中發(fā)現，中性粒細胞（PMN）來源的肝素結合蛋白（HBP）在細菌性膿毒癥發(fā)生的過程中可以監(jiān)控病程發(fā)展以及預后，而且與血管通透性的改變關系密切。在研究A族鏈球菌引起膿毒癥的致

3、病機制中發(fā)現，鏈球菌M蛋白可以與血漿中的纖維蛋白原結合，然后通過β2整合素受體激活PMN脫顆粒釋放HBP，引起血管滲漏。同樣本實驗室的前期研究發(fā)現在豬鏈球菌感染引起的中毒性休克綜合征中，病人血清中的HBP高于正常水平，經過研究發(fā)現豬溶素Sly是其重要的刺激因子，這些研究基礎為我們尋找金葡菌毒力因子與血管內皮細胞之間的作用的新機制提供了重要線索。
　　為了研究金葡菌感染與HBP的關系，我們首先收集了一些金葡菌嚴重感染、具有膿毒癥、多

4、器官衰竭等臨床癥狀的病人血清以及一些健康人血清，另外還收集了多株臨床分離的CA-MRSA和HA-MRSA菌株，進行刺激HBP釋放的評價，確定了HBP濃度升高與金葡菌嚴重感染之間存在顯著相關性。同時結果顯示CA-MRSA的刺激能力比HA-MRSA高，這些為我們進一步的研究金葡菌中HBP的刺激源奠定了基礎。
　　隨后，為了確定上清中的刺激源，我們從性質入手，用蛋白酶K與熱滅活處理確定了刺激源是耐熱蛋白質，通過離子交換柱的分離純化并結合

5、體外活性檢測以及高分辨率的SDS-PAGE分析發(fā)現高活性組分與低活性組分在約3KD處存在差異條帶，然后用乙醇萃取方法將上清中小分子多肽抽離出，經過功能驗證后進行質譜分析，我們共鑒定出了多種活性成分，其中包括3種PSMα（PSMα1，PSMα2，PSMα4）以及δ毒素。
　　結合文獻調研，α型 PSM是金葡菌重要的毒力因子，被認為是引起CA-MRSA高毒力的原因之一，雖然PSMα1-3對中性粒細胞的裂解能力可以達到80％-90%，但

6、是研究發(fā)現血清中的高密度脂蛋白可以與PSMα結合導致其功能喪失。隨后有研究報道PSMα能介導金葡菌在吞噬細胞內裂解細胞進行逃逸的新功能，這也意味著游離的PSMα1-3在生理條件下可能不能有效的發(fā)揮作用。
　　為了進一步研究質譜鑒定出的活性成分與HBP的關系，我們合成了這五種多肽，用模擬人體內環(huán)境的全血體系以及離體 PMN加血清的實驗對它們進行HBP釋放功能評價。結果發(fā)現與其它三種多肽相比，PSMα4可以擺脫血漿脂蛋白的封閉激活中性

7、粒細胞釋放HBP，進而又通過敲除株、互補株實驗確定PSMα4是金葡菌上清中重要的HBP刺激源，并通過觀察CD63分子的移動以及髓過氧化物酶（MPO）和彈性蛋白酶（Elastase）的釋放確定了HBP的釋放是通過PSMα4激活PMN脫顆粒實現的。
　　在對受體和信號通路的研究中，我們發(fā)現甲?；鶎SMα4功能發(fā)揮有重要作用，而文獻報道的PSMα引起的PMN趨化與鈣離子內流不需要甲?；膮⑴c。說明這是FPR2受體介導的兩種不同通路。抑

8、制劑作用發(fā)現PI3K對HBP釋放起重要作用，與細胞骨架重排相關的Rac2分子也可能參與其中。鈣離子螯合劑EGTA以及胞內鈣離子探針結果說明PSMα4引起HBP的釋放與鈣離子內流也有緊密的聯系?？紤]到PSMα4是PSMα四種甲?；闹形ㄒ豢梢源碳BP釋放的，說明除了甲酰基外還有其它的氨基酸位點發(fā)揮作用，我們采用丙氨酸掃描突變法篩選關鍵位點，發(fā)現了一些位點突變會導致PSMα4刺激HBP釋放的能力完全喪失；這些位點究竟如何影響PSMα4的功

9、能有待于進一步的研究。
　　接著我們通過構建單層細胞Transwell模型以及小鼠皮膚滲漏的Miles assay進行PSMα4功能評價。結果發(fā)現PSMα4與PMN作用后的上清會增加內皮細胞的通透性，加入HBP抗體后這種影響會被抑制。同時也檢測到了與脫顆粒緊密相關的呼吸爆發(fā)，這些結果驗證了HBP在PSMα4引起血管內皮細胞通透性改變中的重要作用。在小鼠皮膚滲漏實驗中，野生株、敲除株和互補株上清以及合成多肽評價證明了PSMα4是引起

10、小鼠皮膚血管滲漏的主要原因，通過抑制劑WRW4的實驗結果說明PSMα4是通過FPR-2受體介導滲漏。為了進一步的驗證PMN在這個過程中的重要作用，我們構建了中性粒細胞減少癥（neutropenic）小鼠，野生株培養(yǎng)上清和PSMα4多肽在neutropenic小鼠皮膚造成的滲漏明顯低于野生型小鼠。然后我們將分離得到小鼠 PMN與PSMα4共孵育上清注射進入neutropenic小鼠皮膚內，與對照組多肽相比，實驗組小鼠皮膚出現的滲漏更加嚴重

11、。同時也檢測到了可能與HBP同源類似物同儲存于初級顆粒中的的小鼠髓過氧化物酶（MPO），這些結果進一步證實了在小鼠皮膚上引起血管滲漏的是來自于中性粒細胞的分泌物。
　　最后我們用小鼠感染模型來評價PSMα4通過激活中性粒細胞脫顆粒引起血管滲漏。我們取血管滲漏現象較明顯的肺部進行觀察，通過肺部的組織切片HE染色與掃描電鏡的觀察結果可以看出，感染野生株的小鼠肺組織間隙中有明顯的紅細胞以及血漿的滲出，而敲除株以及PBS對照組沒有這種現象