番茄GDP-L-半乳糖磷酸酶(GGP)基因的克隆、表達(dá)和功能分析.pdf

1、在正常生長條件下，植物細(xì)胞的多種代謝反應(yīng)都會產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)。一定濃度的ROS是植物生長所必須的，而低溫、高溫、鹽漬、干旱、臭氧等脅迫則可導(dǎo)致ROS大量產(chǎn)生，若未及時清除，ROS便會攻擊蛋白質(zhì)、核酸、脂類等生物大分子引起氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞及組織死亡。植物葉綠體是ROS產(chǎn)生的主要部位之一，環(huán)境脅迫下葉綠體內(nèi)ROS的快速清除有助于保護(hù)光合機(jī)構(gòu)，維持植物光合功能?？箟难?AsA)是植物

2、體最主要的水溶性抗氧化物質(zhì)，可以直接清除單線態(tài)氧、超氧陰離子自由基和H2O2，抗壞血酸還可以作為APX及AsA依賴型加雙氧酶的輔酶、參與水--水循環(huán)清除H2O2，且可以作為紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶的輔因子參與葉黃素循環(huán)，此外，抗壞血酸在植物的生長、開花、衰老、細(xì)胞程序性死亡及抵抗各種逆境脅迫中起著重要作用。GDP-L－半乳糖磷酸酶(GGP)是植物AsA合成的關(guān)鍵酶，因此研究GGP基因與植物抗逆性的關(guān)系具有重要意義。
　　 本研究從番茄葉

3、片中克隆了GDP-L－半乳糖磷酸酶基因(SIGGP)，并對該基因的表達(dá)和功能進(jìn)行了分析。主要結(jié)果如下：
　　 (1)利用同源序列設(shè)計引物，通過RT-PCR的方法從番茄葉片克隆到全長cDNA，命名為SlGGP(JQ517313)。該基因全長為1495bp，ORF為1314bp，編碼437個氨基酸，分子量約為49kDa，具有兩個保守區(qū)-HIT(histidine triad)和NLS(nuclear localization seq

4、uence)。
　　 (2)將p35S-SlGGP-GFP融合蛋白在洋蔥表皮瞬時表達(dá)。通過熒光顯微鏡觀察到SlGGP基因產(chǎn)物定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。
　　 (3)qRT-PCR分析表明，SlGGP在葉片中含量最豐富，其次是花，根中表達(dá)量最低。同時該基因的表達(dá)受低溫、NaCl、MV脅迫誘導(dǎo)。
　　 (4)將獲得的SlGGP與含有35S啟動子的pBI121載體重組，分別構(gòu)建了正義和反義表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)

5、化番茄和煙草，用PCR及qRT-PCR的方法對帶卡那抗性的轉(zhuǎn)基因番茄和煙草植株進(jìn)一步檢測，結(jié)果證明成功地獲得了轉(zhuǎn)正義的煙草植株和轉(zhuǎn)反義基因的番茄植株。與野生型相比，轉(zhuǎn)反義SlGGP的番茄葉片的抗壞血酸含量降低為野生型番茄的50％-75％左右，轉(zhuǎn)正義SlGGP煙草抗壞血酸含量升高了約87％-115％。
　　 (5)轉(zhuǎn)反義基因番茄抗壞血酸合成途徑(Smirnoff-Wheeler途徑)中其他相關(guān)酶的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)受到影響，位于

6、SlGGP上游的基因，特別是GME表達(dá)上調(diào)。
　　 (6)構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-SlGGP，并在大腸桿菌BL21中表達(dá)融合蛋白，將誘導(dǎo)帶切下，溶于PBS獲得抗原，免疫小白鼠，其抗血清效價為1:1000。Western雜交表明，低溫誘導(dǎo)SlGGP在蛋白水平的表達(dá)，轉(zhuǎn)反義基因番茄株系SlGGP在蛋白水平的表達(dá)明顯受到抑制，轉(zhuǎn)正義基因煙草株系SlGGP在蛋白水平的表達(dá)增高。
　　 (7)在低溫弱光(4℃，100μmolm-

7、2s-1)脅迫條件下，野生型和轉(zhuǎn)反義基因番茄的凈光合速率(Pn)和PSII最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)下降，但與野生型相比，轉(zhuǎn)反義基因株系T1-1，T1-3和T1-5的下降更為明顯。這表明抑制SlGGP的表達(dá)加劇了PSⅡ的光抑制。在低溫弱光處理過程中，轉(zhuǎn)基因植株與野生型的氧化態(tài)P700降低，轉(zhuǎn)反義基因三個株系下降更明顯。經(jīng)過6h低溫處理，轉(zhuǎn)反義基因和野生型的H2O2和O2-含量及相對電導(dǎo)率均增加，轉(zhuǎn)反義基因植株顯著高于野生型。這些結(jié)果表

8、明，抑制番茄SlGGP的表達(dá)，降低了AsA的含量，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)反義基因番茄的冷敏感性。
　　 在煙草中過表達(dá)SlGGP可以增強(qiáng)煙草抗低溫脅迫的能力。低溫弱光脅迫后，轉(zhuǎn)正義SlGGP煙草的AsA還原狀態(tài)高于野生型，同時表現(xiàn)出較高的抗氧化酶(APX、SOD和POD)活性和D1蛋白含量，PSⅠ和PSⅡ受抑制程度較低。
　　 (8)在MV處理下，野生型煙草的離體葉圓片發(fā)生比轉(zhuǎn)基因煙草更嚴(yán)重的光漂白，轉(zhuǎn)基因煙草的AsA含量、生長量、抗