基于滾環(huán)DNA擴增和納米金的生物傳感技術研究.pdf

1、近年來新的分子生物學技術不斷涌現(xiàn),并在科學研究和實際應用中得到不斷的發(fā)展和完善,使生物分子檢測的靈敏度和特異性都得到很大的提高。但隨著疾病診斷水平的不斷提高和科學研究的不斷深入,對生物分子檢測方法的要求也越來越高。因此,我們迫切需要開發(fā)一些高靈敏性、高特異性、高通量性和高準確性的定性或定量方法,以便更好地滿足研究和實際應用的需要。針對上述問題,本論文在蛋白質和核酸的分析和檢測方面發(fā)展了一系列新的高靈敏性的生物傳感技術,并通過分析實際樣品

2、以及對照經(jīng)典的檢測方法,初步驗證了這些技術的可行性、可靠性及準確性。
　　 (1)核酸適體,是通過體外篩選技術從寡核苷酸庫中隨機篩選出的一段短的與特定的目標分子具有高親和力和高特異性的寡核苷酸探針。在第2章,我們利用核酸適體可與抗體相媲美的特點,基于滾環(huán)DNA擴增技術(RCA),構建了一種新型的高靈敏性的檢測蛋白質的電化學適體傳感器,并實現(xiàn)了對模型蛋白一血小板源生長因子B鏈(PDGF-BB)的高靈敏性和特異性檢測。該方法首先采用

3、巰基乙胺自組裝技術和戊二醛交聯(lián)技術將PDGF-BB抗體固定在金電極表面,然后通過抗體-抗原-核酸適體免疫夾心反應,將帶有RCA引物的PDGF-BB核酸適體連接在金電極上。該適體-引物探針在連接反應組分和滾環(huán)擴增反應組分中對環(huán)形DNA模板進行滾環(huán)放大反應,接著利用生物素標記的探針捕獲擴增產(chǎn)物,再通過生物素-親和素特異性結合將堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素捕捉在金電極上,結合酶的生物催化銀沉積反應放大分析信號,實現(xiàn)對人血清中PDGF-BB的檢測

4、,動態(tài)響應范圍寬達4個數(shù)量級,從10 fM到100 pM,檢測下限可達10 fM,比文獻所報道的高3個數(shù)量級。
　　 (2)上章構建的核酸適體-RCA電化學免疫傳感器實現(xiàn)了對模型蛋白PDGF-BB的高靈敏性檢測,但是到目前為止,已經(jīng)篩選出的核酸適體種類有限,不能滿足大量蛋白質檢測的需要,且核酸適體在蛋白質表面的非特異性吸附會產(chǎn)生一定的背景干擾。第3章中,我們在此實驗的基礎上,利用脂質體包埋DNA技術和滾環(huán)擴增技術,構建了一種超靈

5、敏性的免疫分析方法用于前列腺特異性抗原(PSA)的檢測。首先將PSA抗體吸附在微孔板上,免疫夾心反應后,將表面包被了PSA抗體,里面包埋了RCA引物的脂質體固定在微孔板上,然后溶解脂質體,釋放其內包埋的RCA引物。接著加入滾環(huán)擴增反應組分進行RCA反應,隨后加入生物素標記的探針和熒光素標記的探針與擴增產(chǎn)物雜交,再用親和素標記的微珠捕獲反應產(chǎn)物,最后檢測熒光信號。由于該方法結合了脂質體包埋引物探針和RCA兩步放大反應,分析的靈敏度得到了顯

6、著的提高,響應動態(tài)范圍從0.1 fg/mL到0.1ng/mL,檢測下限為0.08 fg/mL。
　　 (3)第4章中,鑒于RCA技術的高靈敏度,結合核酸外切酶Ⅰ(ExoⅠ)末端保護技術,發(fā)展了一種高靈敏性的檢測模型分析物—葉酸結合蛋白的光學生物傳感技術。該方法利用葉酸與葉酸結合蛋白的特異性結合,保護葉酸標記的單鏈DNA不被ExoⅠ水解,作為后續(xù)RCA反應的成環(huán)模板。當DNA鏈完整存在時,引發(fā)滾環(huán)DNA擴增反應,隨后擴增產(chǎn)物與Ta

7、qman探針雜交,在核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)作用下引發(fā)酶切循環(huán)放大反應,產(chǎn)生熒光信號。結果表明,該方法可實現(xiàn)對葉酸結合蛋白的高靈敏性檢測,響應動態(tài)范圍從1 pM到1 nM,檢測下限為1 pM。
　　 (4)第5章中,我們在上章末端保護技術的基礎上,基于核酸外切酶Ⅲ末端保護技術和納米金凝聚變色效應,提出了一種新型、快速、簡便、靈敏的比色傳感策略用于序列特異性DNA結合蛋白的檢測。首先是包含有目標結合蛋白的結合序列的互補金標探針雜交

8、形成納米金團聚體,溶液呈紫色。目標結合蛋白存在時,與其特定結合序列的特異性結合,保護納米金團聚體不被ExoⅢ水解,溶液保持紫色不變。當目標結合蛋白不存在時,ExoⅢ水解DNA雙鏈,釋放納米金團聚體,納米金呈單顆粒分散狀態(tài),溶液變紅色。結果表明,序列特異性DNA結合蛋白在0～120 nM范圍內呈良好的線性關系,檢測下限為10 nM。
　　 (5)第6章中,建立了一種基于納米金凝聚變色效應的檢測T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)活性

9、的新方法。鑒于寡核苷酸鏈標記的納米金能夠穩(wěn)定存在于一定濃度的鹽離子緩沖溶液中,利用5'羥基修飾的分子信標作為金標探針,有T4 PNK存在時,金標探針5'羥基磷酸化,λ核酸外切酶被激活,酶切分子信標莖部雙鏈DNA片段,接著在RecJ核酸外切酶作用下降解納米金上修飾的殘余的單鏈DNA,使得納米金在一定鹽離子濃度下團聚,溶液變成藍紫色。結果表明,T4 PNK激酶的檢測的線性響應范圍為0～4 U/mL,檢測下限為0.24 U/mL。
　　

10、 (6)第7章中,提出了一種基于胞嘧啶-銀離子-胞嘧啶特定結構(C-Ag+-C)的非標記納米金比色傳感技術用于檢測銀離子(Ag+)。無Ag+存在時,富C鏈吸附在納米金表面,增加了納米金表面的負電荷,從而增加了它們的排斥力,在一定鹽離子濃度下保護納米金不團聚,溶液呈紅色。當Ag+存在時,富C鏈通過C-Ag+-C配對形成準雙鏈結構,不能吸附在納米金表面,沒有DNA鏈保護的納米金顆粒在一定鹽離子濃度下發(fā)生團聚,顏色由紅色變成藍色。結果表明,