基于等溫酶循環(huán)放大技術(shù)的DNA生物傳感分析及應(yīng)用研究.pdf

1、本文采用石英晶體微天平及熒光光譜分析檢測(cè)方法，基于核酸適體與目標(biāo)分子的高親和力以及特異性識(shí)別作用，結(jié)合納米金生物條碼技術(shù)及核酸聚合酶、內(nèi)切酶等工具酶的自身特性，構(gòu)建了基于酶循環(huán)信號(hào)放大方法、DNA自組裝信號(hào)放大方法、滾環(huán)復(fù)制與自組裝循環(huán)放大相結(jié)合、等溫鏈置換放大方法以及滾環(huán)復(fù)制放大方法，實(shí)現(xiàn)了生物小分子、基因及DNA甲基化酶等腫瘤標(biāo)志物的高靈敏及高選擇性檢測(cè)。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴構(gòu)建了新型的石英晶體微天平傳感器，結(jié)合DNA

2、酶循環(huán)放大方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)ATP的高靈敏檢測(cè)。將適體的特異性識(shí)別作用與DNA酶循環(huán)放大相結(jié)合，以納米金生物條碼作為信號(hào)探針，通過鏈替代聚合反應(yīng)，將信號(hào)探針與修飾在芯片表面的捕獲探針相結(jié)合，使檢測(cè)信號(hào)顯著增強(qiáng)，以生物小分子ATP為靶分子，檢測(cè)限達(dá)1.3 nM。利用核酸適體的特異性識(shí)別特點(diǎn)，提高了檢測(cè)的選擇性，并將該方法用于腫瘤細(xì)胞（Ramos）中ATP含量的測(cè)定，進(jìn)一步驗(yàn)證了檢測(cè)系統(tǒng)的實(shí)用性。該方法靈敏度高，選擇性好，適用于復(fù)雜生物樣品中AT

3、P的選擇性分析，為生物學(xué)研究、基于檢測(cè)以及腫瘤的早期診斷提供了有效的分析手段。
　?、铺岢隽俗越M裝雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大的石英晶體微天平檢測(cè)DNA的新方法。將自組裝雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與生物催化沉淀技術(shù)相結(jié)合，增大了芯片表面的質(zhì)量，提高了檢測(cè)靈敏度。通過芯片結(jié)合的靶 DNA引發(fā)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，進(jìn)一步進(jìn)行生物催化沉淀，從而將少量的靶 DNA轉(zhuǎn)化成大量的沉淀物，放大檢測(cè)信號(hào)，采用石英晶體微天平技術(shù)實(shí)現(xiàn)了靶DNA的高靈敏檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)5×10-11M。

4、檢測(cè)系統(tǒng)采用捕獲探針修飾芯片，提高了系統(tǒng)的選擇性，減小了非特異性吸附，有望用于單核苷酸多態(tài)性方面的研究。
　?、腔诘葴匮h(huán)鏈置換聚合擴(kuò)增技術(shù),設(shè)計(jì)了ATP高靈敏檢測(cè)的熒光傳感系統(tǒng)。通過靶分子與適體的特異性識(shí)別作用引發(fā)鏈置換聚合反應(yīng)，在 DNA酶的作用下，一個(gè)鏈置換聚合反應(yīng)的產(chǎn)物作為另一個(gè)反應(yīng)的催化鏈，形成了DNA循環(huán)放大網(wǎng)絡(luò)，提高了反應(yīng)的放大效率，以ATP為目標(biāo)分析物，熒光探針為檢測(cè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了ATP的快速、靈敏檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)2

5、.6×10-10M。成功應(yīng)用于人血清實(shí)際樣品中ATP的分析。該方法適用范圍廣、選擇性強(qiáng)、操作便捷，在生物檢測(cè)方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　?、葮?gòu)建了一種新型DNA級(jí)聯(lián)循環(huán)放大分子機(jī)器，并將其成功應(yīng)用于DNA的高靈敏檢測(cè)。通過靶DNA的雜交互補(bǔ)反應(yīng)引發(fā)模板增強(qiáng)雜交過程（TEHP），在DNA工具酶的作用下發(fā)生滾環(huán)復(fù)制放大反應(yīng)（RCA），生成大量的具有重復(fù)序列的產(chǎn)物，在剪切酶作用下RCA產(chǎn)物引發(fā)發(fā)卡催化自組裝循環(huán)反應(yīng)（CHA），同時(shí)將模板

6、鏈與靶釋放出來形成源頭循環(huán)。通過 DNA級(jí)聯(lián)循環(huán)放大，釋放大量的熒光探針，極大地增強(qiáng)了熒光檢測(cè)信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì) DNA的高靈敏檢測(cè)。DNA的檢測(cè)限為1.2×10-18 M，系統(tǒng)中引入模板增強(qiáng)雜交過程，提高了靶DNA的選擇性，為基因檢測(cè)提供了有效的分析手段。
　　⑸提出了一種基于滾環(huán)復(fù)制放大技術(shù)熒光檢測(cè)DNA甲基化酶的新方法。通過DNA甲基化反應(yīng)生成DNA短鏈，該鏈作為RCA的前體與環(huán)狀模板結(jié)合，在聚合酶作用下發(fā)生滾環(huán)復(fù)制放大反應(yīng)