雙鏈DNA誘導細胞STING蛋白降解及調節(jié)機制研究.pdf

1、干擾素基因刺激蛋白（Stimulator of interferon gene，STING）是雙鏈DNA(double-stranded DNA，dsDNA)誘導機體產生天然免疫反應的重要信號轉導蛋白，在dsDNA的刺激下，STING可介導細胞產生Ⅰ型干擾素(Interferon，IFN)、白介素6(Interleukin6，IL-6)及IL-1β等細胞因子，從而使細胞發(fā)揮抗病毒、抗細菌的作用。作為重要的信號轉導蛋白，STING蛋白水平

2、的高低直接影響天然免疫反應強度，研究STING蛋白水平調節(jié)機制對于有效調節(jié)天然免疫反應強度具有重要意義。以往研究發(fā)現(xiàn)，多種細胞分子機制可通過泛素化蛋白酶體降解方式調節(jié)STING蛋白水平，進而影響其介導天然免疫反應的強度。在此基礎上，我們試圖進一步研究STING蛋白的調節(jié)機制，該工作也可為進一步豐富DNA天然免疫信號通路提供數(shù)據(jù)。
　　在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)質粒DNA轉染可誘導MRC-5細胞中STING蛋白表達水平降低，表現(xiàn)出明顯的時

3、間效應和劑量效應。另外，除了質粒DNA以外，其他dsDNA，如PCR擴增的dsDNA片段、人基因組DNA、不同的病毒基因組DNA都可誘導STING蛋白水平的降低，說明STING蛋白水平下降是dsDNA轉染的一個普遍現(xiàn)象。不同長度DNA片段檢測結果顯示，短于1000bp的DNA片段不能誘導STING蛋白水平的降低。
　　為研究STING蛋白降解的生物學效應，我們對STING蛋白與維甲酸誘導基因Ⅰ(Retinoic acid indu

4、cible geneⅠ，RIG-Ⅰ)、IL-6以及IFN-β之間的關系進行研究。首先，研究下調STING蛋白水平對這三個分子表達水平的影響。利用STING特異性的siRNA(siSTING)下調STING蛋白水平可顯著降低RIG-Ⅰ的表達，首次發(fā)現(xiàn)RIG-Ⅰ除了可作為RNA或DNA感受器外，還可作為STING蛋白激活的下游分子。與已有研究結果相同，下調STING蛋白水平可降低IL-6和IFN-β的表達，以上研究表明這三個分子都是STIN

5、G激活的下游分子。其次研究RIG-Ⅰ、IL-6和IFN-β是否參與調節(jié)STING蛋白的降解，結果發(fā)現(xiàn):1）利用RIG-Ⅰ特異性的siRNA(siRIG-Ⅰ)下調RIG-Ⅰ表達，可部分提高STING蛋白水平，首次發(fā)現(xiàn)RIG-Ⅰ可反向誘導STING蛋白的降解;2）利用IL-6抗體處理細胞，阻斷IL-6的功能，可使STING蛋白水平略有上升，提示IL-6也在一定程度上參與STING蛋白的降解;3）外源加入IFN-β不能降低STING蛋白水平，

6、提示IFN-β本身可能不參與調節(jié)STING蛋白的降解。最后研究RIG-Ⅰ、IL-6和IFN-β之間以及與STING蛋白的相互關系，結果發(fā)現(xiàn)外源加入IFN-β可顯著提高RIG-Ⅰ的表達，提示RIG-Ⅰ和IFN-β是同一信號通路上的兩個分子，RIG-Ⅰ是IFN-β激活的下游分子。單獨加入IFN-β可誘導RIG-Ⅰ表達，但不能誘導STING蛋白的降解，說明RIG-Ⅰ單個分子不能啟動STING蛋白的降解。同時，siRIG-Ⅰ與IL-6抗體共同作

7、用可進一步抑制STING蛋白的降解，提示RIG-Ⅰ與IL-6在誘導STING蛋白降解效應上具有協(xié)同作用，也同樣說明STING蛋白的降解需要多個分子共同作用。總之，STING的激活可以明顯增強RIG-Ⅰ、IL-6和IFN-β的產生，而持續(xù)的RIG-Ⅰ、IL-6以及IFN-β增高又會誘導STING蛋白的降解，說明這是宿主細胞為了避免過強免疫反應所采取的一種負反饋調控機制。
　　為研究STING蛋白的降解機制，利用蛋白酶體抑制劑Bort

8、ezomib共處理質粒轉染細胞并利用免疫共沉淀法檢測發(fā)現(xiàn)，STING蛋白的降解依賴于泛素化-蛋白酶體途徑。然而，特異性下調泛素化E3連接酶RNF5的表達，不能抑制STING蛋白的降解，排除了RNF5作為STING蛋白降解的泛素化E3連接酶的可能。在泛素化位點研究上，誘導突變STING蛋白上所有的賴氨酸殘基均不能抑制STING蛋白的降解，說明STING蛋白的降解可能發(fā)生了非常規(guī)的泛素化修飾。另外，特異性下調干擾素刺激基因(Interfer

9、on stimulated genes，ISG) ISG15蛋白水平，可進一步促進STING蛋白的降解，提示蛋白降解同時受到泛素化和ISG化兩種修飾的反向調節(jié)。
　　為驗證其他細胞是否也存在STING蛋白降解的負反饋調控機制，對人二倍體細胞（2BS和KMB17）、臍帶間充質干細胞及部分腫瘤細胞或永生化細胞系（NCI-H358、Hela、HEK293、NCI-H1703和BEAS）進行檢測，在質粒DNA的刺激下，除HEK293、NC