高脂血癥影響載脂蛋白E基因敲除小鼠對(duì)牙齦卟啉單胞菌的先天免疫并促進(jìn)牙周病進(jìn)展的研究.pdf

1、隨著生活水平的提高，高脂血癥對(duì)中老年身體健康影響逐漸增大。高脂血癥對(duì)全身炎癥和心血管疾病特別是動(dòng)脈粥樣硬化的影響受到了許多關(guān)注，但是其對(duì)牙周病的影響的研究相對(duì)較少。
　　載脂蛋白E基因敲除（Apolipoprotein E knock out，ApoE-/-）小鼠在普通飲食下即形成明顯的高脂血癥，既往研究顯示：在脂多糖（lipopolysacchride，LPS）及多種致病菌刺激下，ApoE-/-小鼠比相同基因背景的C57BL/6

2、J野生型（C57 WT）小鼠血液中細(xì)胞因子水平升高，疾病進(jìn)展加快。我們推測(cè)長(zhǎng)時(shí)間高脂血癥也可能促進(jìn)牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis）感染過(guò)程中細(xì)胞因子的釋放，加速牙周病的進(jìn)展。
　　在本實(shí)驗(yàn)中，為觀測(cè)長(zhǎng)時(shí)間高脂血癥對(duì)牙周病的影響，ApoE-/-及C57 WT小鼠在普通飲食條件下飼養(yǎng)至20 wk。
　　首先，通過(guò)結(jié)扎小鼠雙側(cè)上頜第二磨牙，并接種P.gingivalis，

3、建立牙周炎模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　1）ApoE-/-小鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)明顯的高脂血癥，而體重、血糖等其他身體代謝相關(guān)指標(biāo)未見(jiàn)明顯差異；
　　2）亞甲基藍(lán)染色顯示ApoE-/-小鼠比C57 WT小鼠牙槽骨吸收更為嚴(yán)重；
　　3）牙周炎形成過(guò)程中，血液中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素（interleukin-6，IL-6）水平，ApoE-/-小鼠低于C57 WT小鼠；

4、
　　4）牙周炎形成過(guò)程中，ApoE-/-小鼠牙周清除P.gingivalis能力顯著下降。分析上述結(jié)果，高脂血癥促進(jìn)牙周病的進(jìn)展，可能與其降低了機(jī)體對(duì)P.gingivalis的先天免疫反應(yīng)有關(guān)。
　　接著，為進(jìn)一步研究先天免疫反應(yīng)的變化，通過(guò)腹腔注射P.gingivalis，建立腹腔炎癥模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　1）細(xì)胞因子抗體芯片結(jié)果顯示注射P.gingivalis6h后腹腔液中IL-3、TNF-α和γ干擾素（inte

5、rferon-γ，IFN-γ）等20種細(xì)胞因子表達(dá)下調(diào)，僅巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1-α（macrophage inflammatory protein-1-α，MIP-1-α)和瘦素（leptin）等5種細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)；
　　2）ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示在2 h、6 h、12 h和24 h等多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，ApoE-/-小鼠腹腔沖洗液中，IL-1β、TNF-α、IL-6和單核細(xì)胞趨化因子（monocyte chemotactic prot

6、ein-1，MCP-1）等促炎細(xì)胞因子表達(dá)下調(diào)，而抗炎細(xì)胞因子IL-10表達(dá)未受影響；
　　3）腹腔炎癥形成過(guò)程中，ApoE-/-小鼠腹腔清除P.gingivalis的能力也下降。
　　腹腔炎癥模型的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了高脂血癥降低了機(jī)體對(duì)P.gingivalis的先天免疫反應(yīng)，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了深入研究。
　　在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（peritoneal macrophages，PM），加入P.gi

7、ngivalis刺激。利用小鼠表達(dá)譜基因芯片，研究高脂血癥如何影響機(jī)體對(duì)P.gingivalis的先天免疫；利用real time PCR和ELISA，驗(yàn)證基因芯片結(jié)果的有效性；采用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecepitation,ChIP)，研究高脂血癥對(duì)核因子-κB（nuclear factorκB，NF-κB）p65結(jié)合至染色質(zhì)DNA動(dòng)子序列的影響，結(jié)果顯示：
　　1）在未加入P. gingiv

8、alis時(shí)，與C57 WT小鼠相比，ApoE-/-小鼠PM中353個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，465個(gè)基因下調(diào)表達(dá)；經(jīng)P.gingivalis刺激后，148個(gè)基因上調(diào)，236個(gè)基因下調(diào)；
　　2）基因本體（gene ontology，GO）分析顯示，加入P.gingivalis后，ApoE-/-相對(duì)于C57 WT上調(diào)的基因在生物學(xué)過(guò)程中與nitrogen compound metabolic process、cell adhesion、mul

9、ticellular organismal development、multicellular organismal development、developmental maturation和anatomical structure development等7項(xiàng)功能相關(guān)；而下調(diào)的基因與生物學(xué)過(guò)程中與leukocyte mediated cytotoxicity、regulation of cell killing、positive re

10、gulation of cell killing、immune system process、leukocyte homeostasis、immune effector process等35項(xiàng)功能相關(guān)。
　　3）通路注釋分析（pathway analysis）顯示加入P.gingivalis后，ApoE-/-小鼠與C57 WT相比：
　　a)下調(diào)基因?qū)儆赥oll樣受體（toll like receptor,TLR）通路、JA

11、K-STAT、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體和趨化因子信號(hào)通路等36條通路（基因富集度P<0.05）
　　b)上調(diào)基因?qū)儆诩?xì)胞外基質(zhì)-受體、粘著斑和細(xì)胞粘附分子等16條通路；
　　c)屬于TLR通路的差異表達(dá)基因有Cd86、Cxcl10、Cxcl9、Ifnb1、Il12a、Il6、Irf7和Stat1等8個(gè)，均下調(diào)表達(dá)；
　　d)屬于JAK-STAT通路中Ccnd2、Csf2、Csf3、Ifnb1、Ifng、Il12a、Il1

12、5ra、Il6、Socs1和Stat1等10個(gè)基因差異表達(dá)，且下調(diào)表達(dá)；
　　4）real time PCR顯示TNFa、IL6、IL12a和MCP1等表達(dá)水平與基因芯片基本一致；
　　5）ELISA顯示高脂血癥降低了PM分泌TNF-α、IL-6和MCP-1的水平；
　　6）ChIP顯示高脂血癥降低了NF-κB p65結(jié)合至TNF-α和IL-10啟動(dòng)子序列的能力。
　　結(jié)合上述結(jié)果，高脂血癥下調(diào)了ApoE-/-小

13、鼠TLR通路表達(dá)，影響了細(xì)胞因子分泌和殺滅細(xì)菌等生物學(xué)過(guò)程，可能與NF-κB p65結(jié)合至染色質(zhì)能力下降相關(guān)。
　　細(xì)胞膜上TLR和髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1（triggering receptors expressed on myeloid cells-1，TREM-1)等受體的表達(dá)，將會(huì)直接影響TLR通路介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。為進(jìn)一步研究TLR通路受損的機(jī)制，最后，通過(guò)分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，加入P.gingivalis刺激，分析

14、了高脂血癥對(duì)巨噬細(xì)胞膜表面受體的影響：
　　1）Real time PCR結(jié)果顯示TLR-1、-2、-4和-6、NOD1、NOD、CD14和CD36等20余種膜受體轉(zhuǎn)錄水平未受高脂血癥影響；TREM-1在加入P.gingivalis前后均表達(dá)下調(diào)；
　　2）利用流式細(xì)胞技術(shù)，驗(yàn)證蛋白水平表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TLR-2和-4未受高脂血癥影響，TREM-1表達(dá)下調(diào)；
　　3）Western blot結(jié)果顯示高脂血癥降低了巨噬細(xì)胞胞內(nèi)

15、誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶（induciblenitric oxide synthase，iNOS）水平，減少一氧化氮（nitric oxide，NO）產(chǎn)生，減弱了細(xì)胞內(nèi)殺滅細(xì)菌的功能；
　　4）TREM-1具有放大TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，采用與TREM-1相同氨基酸序列的LP-17多肽預(yù)刺激RAW264.7細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)TREM-1阻斷后，IL-6和TNF-α分泌減少。
　　綜上所述，長(zhǎng)時(shí)間高脂血癥影響了機(jī)體對(duì)P.gingivali