骨髓間充質干細胞復合β-磷酸三鈣修復關節(jié)軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、如何獲得大量優(yōu)質的種子細胞是目前軟骨組織工程亟待解決的關鍵問題.該研究首先探索一種體外高效分離、純化和培養(yǎng)骨髓MSCs的方法,及了解MSCs一般細胞生物學特性,為軟骨組織工程的功能細胞提供實驗基礎.根據(jù)密度梯度離心分離的原理,抽取人骨髓標本5ml,采用比重為1.073g/ml的Percoll分離液梯度離心制備單個有核細胞,按5.0×10<'5>/ml濃度接種于無菌的25cm2塑料培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)體系為含10％FBS的L-DMEM,48h后

2、換液除去未貼壁細胞.利用多孔培養(yǎng)板采用MTT法對培養(yǎng)的MSCs進行細胞生長曲線測定.通過流式細胞儀技術測定MSCs的細胞周期,并選用抗CD34、CD45、CD29、CD44和HLA-DR單克隆抗體,對培養(yǎng)的MSCs進行表型鑒定.結果發(fā)現(xiàn):培養(yǎng)的MSCs為紡錘狀,呈克隆樣生長,原代培養(yǎng)的MSCs克隆數(shù)目平均為43±11個;流式細胞儀檢測結果顯示,G<,0>/G<,1>、S和G<,2>/M期細胞的比例分別為88.17％、6.57％和5.27

3、％;培養(yǎng)的各代細胞對CD29和CD44表面抗原有著較高水平的陽性表達率,而對于CD34、CD45和HLA-DR表面抗原的陽性表達率卻很低,細胞純度達到99％以上.上述結果表明,通過密度梯度離心方法分離培養(yǎng)的細胞不是骨髓造血干/祖細胞,而是一群形態(tài)和表型均一的間充質干細胞,具有獨特的增殖和表型特征及較強的分化潛能.該研究結果表明,采用密度梯度離心方法分離獲得的MSCs,純度高、形態(tài)和表型均一,可以在體外定向分化為軟骨細胞,在體內局部微環(huán)境