早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜水腫形成機制及米諾環(huán)素對視網(wǎng)膜水腫影響的研究.pdf

1、視網(wǎng)膜水腫是許多眼部疾病導(dǎo)致視功能受損的重要原因,如視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞,葡萄膜炎以及糖尿病視網(wǎng)膜病變。特別是糖尿病黃斑水腫(DME)是導(dǎo)致糖尿病病人視力喪失的最常見原因之一。Wisconsin糖尿病視網(wǎng)膜病變研究組研究發(fā)現(xiàn)在I型糖尿病病程超過14年的患者中,糖尿病黃斑水腫發(fā)生率超過26％[1]。視網(wǎng)膜水腫時積聚的液體壓迫視網(wǎng)膜神經(jīng)元,神經(jīng)纖維從而導(dǎo)致神經(jīng)變性,壞死,而水腫時液體對視網(wǎng)膜血管的壓迫則會減少視網(wǎng)膜的血供從而加重視網(wǎng)膜缺血的情

2、況,同時,由于液體的積聚也導(dǎo)致視網(wǎng)膜代謝所需的氧和代謝所需底物彌散距離延長,所有這些都會導(dǎo)致視力下降,視功能受損[2].
　　視網(wǎng)膜間隙內(nèi)積聚的液體既可能由于血視網(wǎng)膜屏障(BRB)受損,液體由血管內(nèi)滲漏到視網(wǎng)膜間隙中所致,也可能是由于視網(wǎng)膜液體清除機制受損,不能及時有效地把液體從視網(wǎng)膜組織中移除到血管中所致[3,4]。正常情況下,液體進(jìn)人視網(wǎng)膜組織和液體從視網(wǎng)膜中被清除的速度保持著動態(tài)平衡,一旦這種平衡被破壞,液體不能及時從視網(wǎng)膜

3、組織中清除,視網(wǎng)膜水腫就會形成。既往的研究表明,有臨床意義的糖尿病黃斑水腫除了有視網(wǎng)膜血管滲漏的因素外,還要有血視網(wǎng)膜屏障的主動轉(zhuǎn)運機制的破壞才會發(fā)生[5]。另一項研究也發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜水腫的產(chǎn)生僅僅有血管滲透性異常是不夠的,還需要伴有視網(wǎng)膜水腫清除機制的不足[6]。在血管照影檢查中沒有發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜血管滲漏的病人中,其黃斑水腫發(fā)生的重要原因就是液體從視網(wǎng)膜實質(zhì)吸收清除的機制受損,由此,視網(wǎng)膜實質(zhì)液體吸收清除機制的功能不足或受損應(yīng)被認(rèn)為是視網(wǎng)膜

4、水腫形成的一個重要病理機制[2]。
　　在正常和健康情況下,視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞如Muller細(xì)胞保持內(nèi)層視網(wǎng)膜持續(xù)處于脫水狀態(tài),以避免出現(xiàn)視網(wǎng)膜水腫,而視網(wǎng)膜下問隙和外層視網(wǎng)膜則由色素上皮細(xì)胞(RPE)的泵的功能發(fā)揮作用,排除液體,從而保證其處于干燥狀態(tài)[3]。Muller細(xì)胞是脊椎動物視網(wǎng)膜上最主要的膠質(zhì)細(xì)胞,貫穿整個視網(wǎng)膜,由于在解剖上與視網(wǎng)膜神經(jīng)元,視網(wǎng)膜血管和玻璃體密切相連[7,8],Miiller細(xì)胞在維持和調(diào)節(jié)血視網(wǎng)膜屏障

5、功能上發(fā)揮重要作用[9]。
　　研究表明Muller細(xì)胞上有兩種蛋白表達(dá):水通道蛋白4(AQP4)和內(nèi)向整流性鉀通道4.1(Kir4.1),這兩種蛋白主要表達(dá)在Miiller細(xì)胞環(huán)繞視網(wǎng)膜血管的細(xì)胞膜上,正是通過這兩種蛋白的幫助,Muller細(xì)胞介導(dǎo)了跨細(xì)胞水的轉(zhuǎn)運從而發(fā)揮其調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜水穩(wěn)態(tài)平衡的重要作用[10]。水通道蛋白是跨細(xì)胞膜水通道蛋白。水通道蛋白1(AQPl),水通道蛋白4(AQP4)和水通道蛋白9(AQP9)已經(jīng)在大腦

6、中被確認(rèn),但是目前發(fā)現(xiàn)水通道蛋白4在腦水腫的病理生理機制中發(fā)揮重要作用,因而正日益受到研究者的重視[11]。
　　在諸如缺血,外傷,腦腫瘤和多發(fā)性硬化等許多人類神經(jīng)病理情況下,水通道蛋白4的表達(dá)都有升高[12,13]。我們以前的研究也發(fā)現(xiàn),大鼠暴露于缺氧環(huán)境后,其視網(wǎng)膜上水通道蛋白4的蛋白和mRNA的表達(dá)也明顯增加[14]。Kir4.1通道蛋白主要位于Mtiller細(xì)胞環(huán)繞視網(wǎng)膜血管的突起以及視網(wǎng)膜的內(nèi)、外界膜上[15.171.可

7、以看出,KiN.1和AQP4共同表達(dá)于Miiller細(xì)胞的特殊膜區(qū)域,它們的這種表達(dá)方式使得人們猜想Miiller細(xì)胞轉(zhuǎn)運水的方式是與其介導(dǎo)的K+空間緩沖相伴隨[10]。Miiller細(xì)胞介導(dǎo)的從視網(wǎng)膜組織中吸收排除液體機制主要依賴于通道介導(dǎo)的鉀離子和水的共轉(zhuǎn)運,任何鉀離子通道的功能失調(diào)應(yīng)該會導(dǎo)致視網(wǎng)膜液體清除障礙,因此將會導(dǎo)致視網(wǎng)膜水腫的形成[2]。
　　糖尿病視網(wǎng)膜病變現(xiàn)在被認(rèn)為是一種炎癥性病變。在糖尿病早期,活化的小膠質(zhì)細(xì)胞

8、以及許多炎癥因子參與到糖尿病視網(wǎng)膜病變的病理過程中。很有可視網(wǎng)膜組織AQP4和Kir4.1的表達(dá)與這些炎癥因子也有關(guān)系,因為最近的研究發(fā)現(xiàn),血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和白介素1-B(IL-1B)參與到AQP4的表達(dá)[18],炎癥因子也改變了培養(yǎng)的星狀膠質(zhì)細(xì)胞的鉀離子電流[19]。米諾環(huán)素是第二代半合成四環(huán)素類藥物,具有抗炎效果,而且其抗炎作用與它的抗菌作用完全無關(guān)。在許多實驗中,米諾環(huán)素一直被用作小膠質(zhì)細(xì)胞的抑制劑[20-23]。近年

9、來的多項研究表明,米諾環(huán)素具有減少炎癥介質(zhì)表達(dá)、拮抗神經(jīng)元凋亡,延緩老年性癡呆、亨廷頓病等神經(jīng)變性疾病的動物及細(xì)胞模型病變進(jìn)展,對于局灶性腦缺血神經(jīng)元具有保護(hù)作用。米諾環(huán)素對減輕視網(wǎng)膜水腫是否有作用尚未見報道,因此本實驗我們以糖尿病動物模型為對象,研究早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜水腫形成機制以及米諾環(huán)素環(huán)素對糖尿病視網(wǎng)膜水腫的影響。
　　第一部分，早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜AQP4,Kir4.1、VEGF,Occludin的表達(dá)改變
　　

10、第一節(jié)，糖尿病動物模型的建立和大鼠視網(wǎng)膜AOP4、Kir4.1的表達(dá)改變
　　目的:探討早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜AQP4、Kir4.1的表達(dá)改變。
　　方法:鏈脈佐菌素(streptozocin,STZ)誘導(dǎo)糖尿病Sprague-Dawleyl(sD)大鼠模型,
　　采用免疫組化法、Westem蛋白印跡法和Realtime-RT-PCR法檢測不同時間(造模成功后l周、2周和4周)大鼠視網(wǎng)膜水通道蛋白4(Aquaporin4

11、,AQP4,內(nèi)向整流性鉀通道4.1(Kir4.1)的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:實驗結(jié)果顯示,糖尿病大鼠1、2周組視網(wǎng)膜AQP4、Kir4.1mRNA和蛋白的表達(dá)與對照組相比無明顯改變;糖尿病4周組大鼠視網(wǎng)膜AOP4mRNA和蛋白的表達(dá)與對照組相比明顯上調(diào);糖尿病4周組大鼠視網(wǎng)膜Kir4.1mRNA和蛋白的表達(dá)與對照組相比明顯下調(diào)。
　　結(jié)論:早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜AQP4、Kir4.1的表達(dá)有差異,在糖尿病4周時,AQP4表達(dá)上調(diào)

12、,Kir4.1的表達(dá)下調(diào)。
　　第二節(jié)，早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF,Occludin的表達(dá)變化情況及血視網(wǎng)膜屏障滲漏檢測
　　目的:探討早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF、Occludin的表達(dá)改變。
　　方法:鏈脈佐菌素(streptozocin,STZ)誘導(dǎo)糖尿病Sprague.Dawley(SD)大鼠模型,
　　采用免疫組化法、Western蛋白印跡法和Realtime-RT-PCR法檢測不同時間(造模成功后1

13、周、2周和4周)大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfacto,VEGF)和血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白(occludin)表達(dá)變化情況。異硫氰酸羅丹明(RHIC)檢測血視網(wǎng)膜屏障滲漏情況。
　　結(jié)果:糖尿病1周,2周,4周時大鼠視網(wǎng)膜VEGFmRNA和蛋白的表達(dá)與對照組相比均明顯增加,而且隨著時間的延長其表達(dá)逐漸升高,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05):糖尿病l周,2周,4周時大鼠視網(wǎng)膜Oc

14、cludinmRNA和蛋白的表達(dá)與對照組相比均明顯降低,而且隨著時問的延長其表達(dá)逐漸下降,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);在糖尿病1周,2周,4周大鼠視網(wǎng)膜都有RHIC滲漏,滲漏位于內(nèi)界膜到外網(wǎng)層,外網(wǎng)層RHIC滲漏最顯著。
　　結(jié)論:早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)升高,Occludin的表達(dá)降低,隨著糖尿病時間延長,VEGF表達(dá)逐漸升高,Oecludin表達(dá)逐漸降低。早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血視網(wǎng)膜內(nèi)屏障有破壞。
　　第

15、二部分，米諾環(huán)素對視網(wǎng)膜水腫影響的研究
　　第一節(jié):米諾環(huán)素對早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF、Occludin的表達(dá)的影響及血視網(wǎng)膜屏障滲漏檢測
　　目的:探討米諾環(huán)素對早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF、Occludin表達(dá)的影響。
　　方法:SD大鼠隨機分為正常對照組;糖尿病4周組:一次性腹腔注射60mg/kgSTZ制造糖尿病模型;糖尿病4周+米諾環(huán)素干預(yù)組:糖尿病造模成功后腹腔注射米諾環(huán)素;米諾環(huán)素對照組:正常大鼠腹腔注

16、射米諾環(huán)素:米諾環(huán)素連續(xù)注射4周后,采用免疫組化法、Western蛋白印跡法和Realtime-RT-PCR法檢測視網(wǎng)膜VEGF、Occludin的表達(dá)變化。異硫氰酸羅丹明(RHIC)檢測血視網(wǎng)膜屏障滲漏情況。
　　結(jié)果:與正常對照組相比,糖尿病4周組和糖尿病+米諾環(huán)素干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜VEGFmRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與正常對照組相比,糖尿病4周組和糖尿病+米諾環(huán)素干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜Occlud

17、inmRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與糖尿病4周組相比,VEGFmRNA和蛋白在糖尿病+米諾環(huán)素干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與糖尿病4周組相比,OccludinmRNA和蛋白在糖尿病+米諾環(huán)素干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與正常對照組相比,米諾環(huán)素對照組中大鼠視網(wǎng)膜VEGF、Occludin表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)
　　

18、結(jié)論:米諾環(huán)素可以下調(diào)早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF的表達(dá),抑制早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Occludin的下調(diào)。米諾環(huán)素對正常大鼠視網(wǎng)膜VEGF和Occludin表達(dá)無影響。
　　第二節(jié):米諾環(huán)素對早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜AQP4、Kir4.1、Iba-1,IL-1B的表達(dá)的影響
　　目的:探討米諾壞素對早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜AQP4、Kir4.1、Iba-1,IL-1B的表達(dá)影響。
　　方法:SD大鼠隨機分為正常對照組;糖尿病4

19、周組:一次性腹腔注射60mg/KgSTZ制造糖尿病模型;糖尿病4周+米諾環(huán)素干預(yù)組:糖尿病造模成功后腹腔注射米諾環(huán)素;米諾壞素對照組:正常大鼠腹腔注射米諾環(huán)素;米諾環(huán)素連續(xù)注射4周后,采用免疫組化法、Western蛋白印跡法和Realtime-RT-PCR法檢測視網(wǎng)膜AQP4、Kir4.1的表達(dá)變化。Western蛋白印跡法和Realtime-RT-PCR法檢測視網(wǎng)膜lba-1,lL-1B的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:與正常對照組相比,

20、糖尿病4周組和糖尿病4周+米諾環(huán)素干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜AQP4、Iba-l,IL一1BmRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與正常對照組相比,糖尿病4周組和糖尿病+米諾環(huán)素干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜Kjr4.1mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與糖尿病4周組相比,AQP4、Iba-1,IL-1BmRNA和蛋白在糖尿病4周+米諾環(huán)素干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);

21、與糖尿病4周組相比,Kir4.1mRNA和蛋白在糖尿病+米諾環(huán)素干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與正常對照組相比,米諾環(huán)素對照組中大鼠視網(wǎng)膜AQP4、Iba-1,IL-1B,Kir4.1mRNA和蛋白表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)
　　結(jié)論:米諾環(huán)素可以抑制早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜AQP4、Iba-1,IL-1B的表達(dá),抑制早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Kir4.1的下調(diào)。米諾環(huán)素對正常大鼠視網(wǎng)膜AOP4、Ib