金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)座子突變文庫(kù)的構(gòu)建與腸毒素A相關(guān)基因的研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）簡(jiǎn)稱(chēng)金葡菌，是一種重要的食源性致病菌，其引起食物中毒的主要致病因子是腸毒素。由于進(jìn)食被金黃色葡萄球菌及其產(chǎn)生的腸毒素所污染的食物而引起的食物中毒被稱(chēng)為金黃色葡萄球菌食物中毒(Staphylococcal food poisoning，SFP)，一般在短時(shí)間內(nèi)就會(huì)有相應(yīng)的癥狀發(fā)作，包括惡心、嘔吐、腹部絞痛或腹瀉等。由于金黃色葡萄球菌無(wú)處不在，廣泛分布于空氣、灰塵

2、和食品加工設(shè)備表面等，使得食品極易產(chǎn)生交叉污染，所以盡管?chē)?yán)格控制食品加工的各個(gè)過(guò)程，還是會(huì)受到不同程度的污染。其中，食源性動(dòng)物和食品加工者的手或呼吸道分泌物被視為食品污染金葡菌的主要來(lái)源。在常見(jiàn)的金葡菌食物中毒事件中，大部分是由SEA引起的，其次依次是SED、SEC、SEB和SEE。轉(zhuǎn)座子(transposon)是細(xì)菌和許多原核與真核生物基因組中一段特異的具有轉(zhuǎn)位特性的獨(dú)立的DNA序列，可以在細(xì)菌的染色體、質(zhì)?；蚴删w之間水平轉(zhuǎn)移。研究

3、質(zhì)粒消除和Tn917轉(zhuǎn)座子的隨機(jī)插入對(duì)食源性金黃色葡萄球菌腸毒素A表達(dá)的影響，是本課題的主要研究?jī)?nèi)容。
　　本研究對(duì)48株不同來(lái)源并攜帶腸毒素sea基因的金葡菌先進(jìn)行質(zhì)粒消除，再對(duì)消除前后菌株進(jìn)行18種腸毒素基因和29種耐藥基因的PCR檢測(cè)，以及12種臨床常用抗生素的藥敏檢測(cè)。隨后將質(zhì)粒消除后金葡菌通過(guò)隨機(jī)插入轉(zhuǎn)座子Tn917對(duì)其染色體進(jìn)行誘變，產(chǎn)生變異體，并建立轉(zhuǎn)座子文庫(kù)。最后通過(guò)ELISA方法篩選腸毒素A表達(dá)異常的菌株，同時(shí)檢

4、測(cè)生物膜形成能力以及產(chǎn)溶血毒素異常的突變株，并與原始菌株比較其差異性。這為闡明腸毒素A分子機(jī)制和金黃色葡萄球菌引起食物中毒的防控提供了理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)對(duì)48株不同來(lái)源并攜帶腸毒素sea基因的金葡菌先進(jìn)行質(zhì)粒消除，再對(duì)消除前后菌株進(jìn)行18種腸毒素基因和29種耐藥基因的PCR檢測(cè)，以及12種臨床常用抗生素的藥敏檢測(cè)。結(jié)果表明，質(zhì)粒消除對(duì)腸毒素基因see，耐藥基因tetO和tetK，以及抗生素AMP的影響較為顯著

5、，對(duì)ERY有影響但不顯著，說(shuō)明耐藥基因tetO和tetK存在細(xì)菌質(zhì)粒上，以及AMP和ERY的基因也可能在質(zhì)粒上。金葡菌的腸毒素基因和耐藥基因位點(diǎn)比較復(fù)雜，同種基因在不同菌株間存在差異，說(shuō)明其具有無(wú)規(guī)律性。此外，耐藥基因型和耐藥表型之間也存在一定差異。
　　(2)將含有轉(zhuǎn)座子Tn917的溫敏穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)入菌株Y1和Y2中，并在ERY和42℃高溫條件下進(jìn)行誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座。在初步建立轉(zhuǎn)座子文庫(kù)中，我們隨機(jī)挑取200個(gè)單菌落進(jìn)行抗性篩選，最終得到