杜氏鹽藻多糖的提取、分離分析及其生物活性的研究.pdf

1、杜氏鹽藻(Duanaliella salina)是單細胞、無細胞壁的綠藻類浮游生物，一般生長于海水、咸水湖及鹽池中。人工大規(guī)模培養(yǎng)杜氏鹽藻主要用于生產(chǎn)β-胡蘿卜素。以往人們對杜氏鹽藻的生物學(xué)特性和生產(chǎn)培養(yǎng)技術(shù)及其中積累的高含量β-胡蘿卜素的提取分離研究較多，而對杜氏鹽藻中高達10-40％的多糖類物質(zhì)的研究利用較少，尤其是對其多糖的組成、結(jié)構(gòu)及生物活性等方面的基礎(chǔ)研究不夠系統(tǒng)和深入。從鹽藻中提取出β-胡蘿卜素后的藻渣中仍含有豐富的多糖、蛋

2、白質(zhì)、維生素及微量元素等可利用的營養(yǎng)成分，其中多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性。因此，深入研究和開發(fā)鹽藻多糖，對于充分利用鹽藻渣資源，提高鹽藻開發(fā)的綜合效益具有重要意義。本論文對提取出β-胡蘿卜素后的杜氏鹽藻渣中多糖的提取、分離分析(包括分離純化、純度鑒定、相對分子量分布分析、組成及結(jié)構(gòu)分析)及其生物活性等方面進行了較系統(tǒng)深入的研究和探索。結(jié)果如下： 分析了原料杜氏鹽藻渣粉的化學(xué)組成為：總蛋白43.15％，粗脂肪0

3、.4％，總糖15.40％，粗纖維0.35％，灰分15.13％，水分8.24％。 在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，以多糖得率為響應(yīng)值作響應(yīng)面，并進行回歸分析，其結(jié)果表明，杜氏鹽藻多糖提取的最佳工藝條件為：提取溫度81℃，提取液pH8.80，提取時間210 min；液料比為16:1(v/w)時，杜氏鹽藻多糖的得率達到8.77％。以最佳工藝提取得到的杜氏鹽藻粗多糖的化學(xué)組成為：多糖78.31％，糖醛酸3.81％，蛋

4、白質(zhì)4.40％，硫酸基3.27％，灰分7.60％。最佳工藝的堿性提取條件下，多種不同相對分子量分布和不同性質(zhì)的多糖組分均能得到較充分的提取，而水提工藝不僅得率低，而且粗多糖產(chǎn)品中，相對分子量100KDa以上的粗多糖含量較少。 將杜氏鹽藻粗多糖經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow柱層析分離得到PD1、PD2、PD3、及PD4四個級分，PD4又通過Sepharose CL6B柱層析分離得到PD4a和PD4b兩個級分。高

5、效體積排阻色譜和瓊脂糖凝膠電泳及高效毛細管電泳分析結(jié)果顯示，PD4a、PD4b、及PD1、 PD2和PD3皆為均一組分。 對PMP柱前衍生化高效液相色譜法分析多糖中單糖組成的色譜分離和衍生化條件及PD4a、PD4b的水解條件進行了優(yōu)化和改進，并以改進的方法測定了五個杜氏鹽藻多糖級分的單糖組成，利用離子色譜法對PMP柱前衍生化高效液相色譜法的測定結(jié)果進行了驗證，兩方法結(jié)果基本一致。改進后的PMP柱前衍生化高效液相色譜法同時分析12

6、種單糖的色譜分離條件為：色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，250mm×4.6mmid,5μm； 流動相：0.1mol/L磷酸鹽(pH6.7)緩沖液-乙腈(體積比為83:17)；優(yōu)化的衍生化反應(yīng)時間為100min，中和反應(yīng)產(chǎn)物的pH為6.7；適合PD4a和PD4b的水解條件分別為：2mol/L TFA，110℃，4h和2mol/L TFA，121℃，2h?；瘜W(xué)分析、高效液相色譜和紫外、紅外光譜分析及核酸酶水解法

7、分析結(jié)果表明：PD1是相對分子量為1548KDa硫酸化葡聚糖(硫酸基含量為6.93％)，PD4a為相對分子量為424，KDa、含有糖醛酸和少量肽鏈的硫酸化雜多糖(硫酸基含量為8.36)；PD4b是一相對分子量為424 KDa、含有少量糖醛酸和肽鏈的核酸多糖復(fù)合物，其中以共價結(jié)合的核酸含量為49.26~,，0；PD2和PD3均為葡聚糖，相對分子量分別為33 KDa和67 KDa，PD3且含有少量肽鏈。PD4a 的單糖組成為 (mol％)：

8、 Man：Rib:Rha:GlcUA:GalUA:Glc:Gal:Xgl:Ara:Fuc=5.04:0.71:3.6:2.41:5.26:5.38:42.04:11.56:19.48:4.52；PD4b也由上述10種單糖組成，其摩爾比為：3.48:67.80:1.34：2.36:2.70：4.69：8.40：4.25：3.61：1.37。PD4b中核酸的堿基組成(mol％)為：G:A:C:U:T=39.18：40.54：10.67：0.

9、75：8.86。五個多糖級分PD1，PD2，PD3，PD4a及PD4b的糖殘基異頭碳構(gòu)型均為α型，旋光性分析的結(jié)果與紅外光譜及單糖組成分析結(jié)果一致。 通過對杜氏鹽藻中提取出的不同多糖級分，主要是PD4a、PD4b及PD1三級分在HPSEC柱上的保留和分離特性及其影響因素的考察，較好地優(yōu)化了分離分析條件，研究建立了HPSEC分析鹽藻多糖的方法，并將該方法成功地應(yīng)用于鹽藻多糖分離級分(特別是PD4)的純度鑒定和相對分子量及其分布的測

10、定，并針對PD4a，PD4b及PD1三者在不同條件下表現(xiàn)出的“二級效應(yīng)”，特別是硫酸基的非特異性吸附作用及其對多糖的保留行為的影響進行了有意義的探索。其結(jié)果表明：要消除硫酸基的“二級效應(yīng)”，對于相對分子量較大的硫酸化多糖，流動相中鹽的濃度需較大，對于相對分子量較小的硫酸化多糖，則鹽的濃度可較??；NaNO<,3>和NaC1的水溶液不宜取代NaAc溶液作為本文選定的色譜柱條件下的流動相用于鹽藻多糖的HPSEC分離分析，同樣濃度的不同種鹽溶液

11、的離子強度及對“二級效應(yīng)”的抑制作用相差較大。 甲基化分析和核磁共振分析結(jié)果表明：PD1是一線型的α-(1→4)-D-葡聚糖，在部分0-6上取代有硫酸基。PD4a主要由1，4-連接的α-D-Galp構(gòu)成主鏈，在主鏈Gal的2或3位有多種類型的分支，分別由Ara，Xyl，Rha，Gal構(gòu)成非還原末端；其中一種含量較高的分支是由Ara取代于1，4-連接的主鏈半乳糖的3-O上；硫酸基主要取代于主鏈的Gal的C2位；支鏈中含有2-Gal

12、，3-Gal，3,6-Gal，4-Glc，2-Rha多種連接方式的糖基。 體外促脾淋巴細胞增殖活性結(jié)果表明：PD2、PD3均沒有明顯的促脾淋巴細胞增殖活性，而PD1、PD4和由PD4進一步分離得到的PD4a和PD4b兩個組分均有顯著的促脾淋巴細胞增殖活性，并具有量效關(guān)系。PD1、PD4圾PD4a具有顯著協(xié)同ConA促脾淋巴細胞增殖活性，但無明顯的量效關(guān)系；PD4b無明顯協(xié)同ConA促脾淋巴細胞增殖活性。PD1、PD4a、PD4b

13、均無協(xié)同LPS促進脾淋巴細胞增殖活性。此外，PD4a還能顯著地促進正常小鼠脾淋巴細胞生成IL-2。因此，PD1、PD4及PD4a具有顯著促進小鼠的特異性免疫的功能，主要是特異性的細胞免疫功能。體內(nèi)對正常小鼠碳粒廓清速率的影響實驗結(jié)果顯示，PD4b、PD1和降解后的PD4a能顯著提高小鼠的中性粒細胞和巨噬細胞的吞噬能力，因而具有顯著提高小鼠非特異性免疫功能的活性。另外，PD4a和PD4b還對正常小鼠的血清溶血素具有顯著的促進作用，均能顯著

14、提高小鼠特異性體液免疫功能。 脫硫和降解后PD4a及酶解后PD4lb的體外促脾淋巴細胞增殖活性試驗與體內(nèi)對正常小鼠碳粒廓清速率的影響實驗的結(jié)果均表明：PD4a的硫酸基和PD4b的核酸部分分別與兩者的免疫活性有一定的相關(guān)性；適當?shù)慕到饪商岣逷D4a的免疫活性。 體外抗病毒活性的試驗證實，杜氏藻中硫酸化多糖PD4a具有顯著的抗流感病毒活性。PD4a的相對分子量為424KDa，與Fabregas關(guān)于杜氏藻(D.tertiole

15、cta)中抗病毒的活性成分可能是相對分子量為500KDa左右的硫酸化多糖的推測相吻合。 體外試驗結(jié)果顯示：PD4對S180、A549和MDA-MB-231三種腫瘤細胞具有一定的抑制作用，對KB和Lovo腫瘤細胞的抑制率較高，最高抑制率在60％左右；PD4a和PD4b對KB和Lvov腫瘤細胞均有一定的抑制作用。該結(jié)果表明，PD4和PD4a、PD4b對上述腫瘤細胞有一定的細胞毒作用。 體內(nèi)抗腫瘤試驗結(jié)果顯示：PD4高劑量組對