地黃梓醇提取分離工藝及其生物活性研究.pdf

1、中藥地黃為玄參科植物地黃(Rehmannia glutinosa Libosch．)的新鮮或干燥塊根，為常用的補益中藥，具有滋陰清熱、補血止血等功效，臨床應(yīng)用極為廣泛。收載于《中華人民共和國藥典》(2005年版，一部)。主產(chǎn)于河南、河北、山東、山西、內(nèi)蒙古及東北，現(xiàn)全國大部分地區(qū)有栽培?；瘜W(xué)成分和藥理活性研究表明環(huán)烯醚萜苷類和糖類是地黃的主要化學(xué)成分和活性部位。梓醇是地黃中含量最高的環(huán)烯醚萜單糖苷，為地黃的主要活性成分之一，具有利尿、緩

2、和瀉下、降血糖、神經(jīng)保護等生物活性。近年人們對梓醇提取分離的生產(chǎn)工藝進行了許多探索，但由于天然產(chǎn)物成分復(fù)雜，含量相對較低，加上梓醇等環(huán)烯醚萜苷類化合物結(jié)構(gòu)近似，極性較大，而且化學(xué)穩(wěn)定性較差，因而大量制備純度在90％以上的單體成分難度較大，到目前為止梓醇大量制備的生產(chǎn)工藝還未得到解決，從而限制了梓醇的生物活性研究與開發(fā)應(yīng)用。 本課題采用適合生產(chǎn)的提取分離方法對梓醇的分離純化進行了研究，并對其進行了降血糖等生物活性的研究，主要內(nèi)容和

3、結(jié)果如下： 1．在建立梓醇含量測定方法的基礎(chǔ)上，以梓醇得率為考察指標，采用正交設(shè)計法，對地黃梓醇的最佳提取工藝進行了實驗研究。結(jié)果表明，以10倍量的80％乙醇提取2次，每次提取1.5 h，提取率達80％以上。并且通過藥材的前處理使梓醇在提取分離過程中的穩(wěn)定性得到了保證。 本文比較了非極性、弱極性、極性三種類型大孔吸附樹脂對梓醇的吸附分離效果，結(jié)果表明大孔吸附樹脂H103是分離純化梓醇較理想的大孔吸附樹脂。地黃的乙醇提取物

4、通過大孔吸附樹脂H103柱層析和重結(jié)晶處理，得到單體成分梓醇含量大于90％的純化樣品，符合中藥、天然藥物注冊分類1類新藥申報要求。其結(jié)構(gòu)通過核磁、質(zhì)譜和理化性質(zhì)得到確證。在此基礎(chǔ)上對梓醇的生物活性進行了實驗研究。 2．根據(jù)梓醇的生物活性和地黃對免疫的雙向調(diào)節(jié)作用，采用體內(nèi)外實驗篩選了梓醇的免疫調(diào)節(jié)活性、對PCI2細胞的保護作用和降糖作用。首先，觀察了梓醇對KM小鼠免疫器官指數(shù)、ConA刺激的脾淋巴細胞增殖反應(yīng)、混合淋巴細胞反應(yīng)、

5、Balb/c小鼠異體移植皮片存活時間的影響。接著觀察了梓醇對血清饑餓、丙二酸鈉損傷的PCI2細胞增殖的影響。最后觀察了梓醇對正常小鼠葡萄糖致高血糖水平和C2C12細胞葡萄糖消耗的影響。結(jié)果表明，梓醇沒有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用和對PC12細胞的保護作用，但能顯著降低正常小鼠葡萄糖致高血糖水平，促進C2C12細胞的葡萄糖消耗。由此進一步觀察了梓醇對四氧嘧啶糖尿病小鼠的降糖作用及其作用機制，以及對HepG2細胞的葡萄糖消耗和βTC3細胞的胰島素分

6、泌的影響。 3．動物實驗結(jié)果表明，梓醇對四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖升高有明顯的抑制作用，同時能顯著改善糖尿病小鼠的糖耐量。其作用與臨床上常用的降糖藥鹽酸二甲雙胍的降糖效果接近，并且呈劑量依賴關(guān)系。血清胰島素水平和肝臟胰島素受體數(shù)量檢測提示，梓醇對糖尿病小鼠的胰島素分泌沒有明顯影響，但可顯著提高肝臟胰島素受體的表達。糖脂代謝紊亂是糖尿病并發(fā)癥的一個重要因素，梓醇能明顯提高糖尿病小鼠的肝糖原和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量，降低

7、血清總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平，提示梓醇能全面調(diào)節(jié)糖尿病小鼠的糖脂代謝，對糖尿病并發(fā)癥具有一定的預(yù)防作用。血清生化指標肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)，以及肝臟、脾臟的組織形態(tài)學(xué)觀察表明，梓醇對糖尿病小鼠的肝臟、心臟和脾臟功能具有一定的保護作用。細胞實驗結(jié)果表明，梓醇在高糖條件下可明顯增加肝癌細胞HepG2的葡萄糖消耗，但在低糖條件下對HepG2細胞的葡萄糖消耗

8、沒有明顯影響，同時能增加胰島素的敏感性，提高胰島素受體的表達，但對pTC3細胞的胰島素分泌沒有明顯影響。以上結(jié)果提示，梓醇通過調(diào)節(jié)糖脂代謝、增加胰島素的敏感性和胰島素受體的表達、保護心、肝、脾等臟器免受高血糖損傷等而發(fā)揮降糖作用。 4．急性毒性試驗結(jié)果顯示，梓醇小鼠灌胃的MTD大于10 g/kg，為藥效學(xué)有效劑量的100倍，與正常對照組相比，體重及行為無明顯差異，解剖學(xué)研究也未發(fā)現(xiàn)異常。 以上研究結(jié)果將為梓醇的進一步開發(fā)