地黃梓醇提取分離工藝及其生物活性研究.pdf

1、中藥地黃為玄參科植物地黃(Rehmannia glutinosa Libosch．)的新鮮或干燥塊根，為常用的補(bǔ)益中藥，具有滋陰清熱、補(bǔ)血止血等功效，臨床應(yīng)用極為廣泛。收載于《中華人民共和國藥典》(2005年版，一部)。主產(chǎn)于河南、河北、山東、山西、內(nèi)蒙古及東北，現(xiàn)全國大部分地區(qū)有栽培。化學(xué)成分和藥理活性研究表明環(huán)烯醚萜苷類和糖類是地黃的主要化學(xué)成分和活性部位。梓醇是地黃中含量最高的環(huán)烯醚萜單糖苷，為地黃的主要活性成分之一，具有利尿、緩

2、和瀉下、降血糖、神經(jīng)保護(hù)等生物活性。近年人們對(duì)梓醇提取分離的生產(chǎn)工藝進(jìn)行了許多探索，但由于天然產(chǎn)物成分復(fù)雜，含量相對(duì)較低，加上梓醇等環(huán)烯醚萜苷類化合物結(jié)構(gòu)近似，極性較大，而且化學(xué)穩(wěn)定性較差，因而大量制備純度在90％以上的單體成分難度較大，到目前為止梓醇大量制備的生產(chǎn)工藝還未得到解決，從而限制了梓醇的生物活性研究與開發(fā)應(yīng)用。 本課題采用適合生產(chǎn)的提取分離方法對(duì)梓醇的分離純化進(jìn)行了研究，并對(duì)其進(jìn)行了降血糖等生物活性的研究，主要內(nèi)容和

3、結(jié)果如下： 1．在建立梓醇含量測(cè)定方法的基礎(chǔ)上，以梓醇得率為考察指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)法，對(duì)地黃梓醇的最佳提取工藝進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果表明，以10倍量的80％乙醇提取2次，每次提取1.5 h，提取率達(dá)80％以上。并且通過藥材的前處理使梓醇在提取分離過程中的穩(wěn)定性得到了保證。 本文比較了非極性、弱極性、極性三種類型大孔吸附樹脂對(duì)梓醇的吸附分離效果，結(jié)果表明大孔吸附樹脂H103是分離純化梓醇較理想的大孔吸附樹脂。地黃的乙醇提取物

4、通過大孔吸附樹脂H103柱層析和重結(jié)晶處理，得到單體成分梓醇含量大于90％的純化樣品，符合中藥、天然藥物注冊(cè)分類1類新藥申報(bào)要求。其結(jié)構(gòu)通過核磁、質(zhì)譜和理化性質(zhì)得到確證。在此基礎(chǔ)上對(duì)梓醇的生物活性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。 2．根據(jù)梓醇的生物活性和地黃對(duì)免疫的雙向調(diào)節(jié)作用，采用體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)篩選了梓醇的免疫調(diào)節(jié)活性、對(duì)PCI2細(xì)胞的保護(hù)作用和降糖作用。首先，觀察了梓醇對(duì)KM小鼠免疫器官指數(shù)、ConA刺激的脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)、

5、Balb/c小鼠異體移植皮片存活時(shí)間的影響。接著觀察了梓醇對(duì)血清饑餓、丙二酸鈉損傷的PCI2細(xì)胞增殖的影響。最后觀察了梓醇對(duì)正常小鼠葡萄糖致高血糖水平和C2C12細(xì)胞葡萄糖消耗的影響。結(jié)果表明，梓醇沒有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用和對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，但能顯著降低正常小鼠葡萄糖致高血糖水平，促進(jìn)C2C12細(xì)胞的葡萄糖消耗。由此進(jìn)一步觀察了梓醇對(duì)四氧嘧啶糖尿病小鼠的降糖作用及其作用機(jī)制，以及對(duì)HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗和βTC3細(xì)胞的胰島素分

6、泌的影響。 3．動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，梓醇對(duì)四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖升高有明顯的抑制作用，同時(shí)能顯著改善糖尿病小鼠的糖耐量。其作用與臨床上常用的降糖藥鹽酸二甲雙胍的降糖效果接近，并且呈劑量依賴關(guān)系。血清胰島素水平和肝臟胰島素受體數(shù)量檢測(cè)提示，梓醇對(duì)糖尿病小鼠的胰島素分泌沒有明顯影響，但可顯著提高肝臟胰島素受體的表達(dá)。糖脂代謝紊亂是糖尿病并發(fā)癥的一個(gè)重要因素，梓醇能明顯提高糖尿病小鼠的肝糖原和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量，降低

7、血清總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平，提示梓醇能全面調(diào)節(jié)糖尿病小鼠的糖脂代謝，對(duì)糖尿病并發(fā)癥具有一定的預(yù)防作用。血清生化指標(biāo)肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)，以及肝臟、脾臟的組織形態(tài)學(xué)觀察表明，梓醇對(duì)糖尿病小鼠的肝臟、心臟和脾臟功能具有一定的保護(hù)作用。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，梓醇在高糖條件下可明顯增加肝癌細(xì)胞HepG2的葡萄糖消耗，但在低糖條件下對(duì)HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗

8、沒有明顯影響，同時(shí)能增加胰島素的敏感性，提高胰島素受體的表達(dá)，但對(duì)pTC3細(xì)胞的胰島素分泌沒有明顯影響。以上結(jié)果提示，梓醇通過調(diào)節(jié)糖脂代謝、增加胰島素的敏感性和胰島素受體的表達(dá)、保護(hù)心、肝、脾等臟器免受高血糖損傷等而發(fā)揮降糖作用。 4．急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，梓醇小鼠灌胃的MTD大于10 g/kg，為藥效學(xué)有效劑量的100倍，與正常對(duì)照組相比，體重及行為無明顯差異，解剖學(xué)研究也未發(fā)現(xiàn)異常。 以上研究結(jié)果將為梓醇的進(jìn)一步開發(fā)