一種分離正常成年大鼠肝臟祖細胞新方法的研究.pdf

1、研究背景:
　　 急性肝衰竭是一種可以由各種急性或慢性肝病引起的少見但致命的疾病。目前肝移植被認為是終末期肝病患者重要的治療方法。然而,肝移植的可行性受到成本高、供體器官短缺、手術技術要求高、需要服用免疫抑制劑等因素的限制。由于各種肝衰竭多由肝功能紊亂所致,而肝細胞或肝細胞樣細胞移植后可發(fā)揮正常功能,因此,肝細胞或肝細胞樣細胞移植是急性和慢性肝功能衰竭很有前途的替代療法之一。不過這種療法同樣受到供體細胞的缺乏和免疫排異的限制。肝

2、干／祖細胞有良好的增殖潛能,且有較低的免疫源性,有可能用于細胞移植以取代肝移植治療終末期肝病。因此,對諸如成熟細胞或干／祖細胞的移植以及移植異種器官的研究方興未艾。大量研究表明肝干／祖細胞存在于成年嚙齒類動物和成人的肝臟中,這群細胞共表達肝細胞和干細胞的表面標志。然而,目前研究認為在正常成年肝臟中,肝干／祖細胞處于靜止狀態(tài),僅有少量肝干／祖細胞出現(xiàn)于匯管區(qū),且只有受到嚴重創(chuàng)傷時才會出現(xiàn)肝干／祖細胞的增殖。最近,不少有關肝衰竭模型的研究指

3、出,從這些模型中可以分離出大量的肝干／祖細胞,如二乙基亞硝胺模型大鼠、2-AAF／肝切模型大鼠以及倒千里光堿／肝切模型大鼠。盡管應用的化學試劑多種多樣,但這些實驗方法的目的都是為了使造模動物產生嚴重、持續(xù)的肝損傷。雖然從這些疾病模型動物中可以分離出大量的肝干／祖細胞,但這些細胞都來自于異常個體。有假說稱在整個肝癌的發(fā)展過程中,肝干／祖細胞發(fā)揮重要的作用。那么即使大量的肝干／祖細胞可以分離自肝臟,但細胞的品質無法得到保證。目前為止,尚無一

4、種好的實驗方法能夠獲得大量的純度高、活性好的肝干／祖細胞,肝干／祖細胞體外分離、純化、鑒定、體外培養(yǎng)技術有待于進一步完備,這些因素都是制約肝干／祖細胞臨床應用的瓶頸。
　　 研究目的:
　　 利用正常肝臟探索建立一套肝干／祖細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定的新方法。
　　 研究方法:
　　 通過四步膠原酶灌注法與密度梯度離心技術相結合,分離正常成年大鼠肝祖細胞。通過形態(tài)學觀察、RT-PCR和免疫細胞化學分析肝祖細胞

5、的形態(tài)、表型。
　　 研究結果:
　　 采用本課題組建立的四步膠原酶灌注法與密度梯度離心技術相結合,可從正常大鼠肝臟中分離出細胞數(shù)為2.5±0.5×104／100g的肝祖細胞,肝祖細胞的活率是95％／±2％。新鮮分離的大鼠肝祖胞用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液制成肝祖細胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中體外培養(yǎng)。結果顯示體外培養(yǎng)的第3天,肝祖細胞可形成松散的克隆,細胞形態(tài)上為圓形或卵圓形。在體外30天的培養(yǎng)期間,這些細胞緩慢增殖

6、,并顯示出祖細胞的特性。RT-PCR結果顯示這群祖細胞不僅表達成熟肝細胞的表面標志ALB、AFP、CK18、CK19、HNF-1a、HNF-4a的mRNA,還表達造血干細胞的表面標志Thy-1、CD45的mRNA。免疫細胞化學染色表明這群細胞表達ALB、AFP、CK18、CK19、Thy-1和OV-6。
　　 結論:
　　 通過簡單有效的四步灌流法結合密度梯度離心法所獲得的肝祖細胞有良好的增殖能力,能表達干細胞和肝細胞的