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文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景:近年來(lái)非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的發(fā)病率升高。研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境因素、遺傳因素、飲食因素或行為因素等并不能解釋NAFLD的全部病因。大量研究表明胎兒宮內(nèi)缺氧(prenatal hypoxia,PH)不僅會(huì)引起胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限,還會(huì)造成胎兒重要組織器官的發(fā)育不良,以及成年后的代謝異常。PH對(duì)胎兒肝臟發(fā)育造成怎樣的影響,對(duì)子代成年后NAFLD易感性有怎樣的影響及其機(jī)制,
2、目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道甚少。腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)是重要內(nèi)分泌系統(tǒng)。近年來(lái)研究證實(shí)PH可影響RAS功能,且RAS與機(jī)體代謝調(diào)節(jié)特別是胰島素抵抗(insulin resistance,IRl密切相關(guān)。而PH對(duì)胎兒肝臟RAS的影響及其在成年子代NAFLD易感性改變的機(jī)制中的作用,國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用大鼠及原代培養(yǎng)的胎羊肝細(xì)胞,分別從整體、組織器官、細(xì)胞、分子水平,就PH對(duì)成年子代N
3、AFLD易感性的影響機(jī)制及肝臟RAS在其中的作用進(jìn)行了研究。
第一部分富內(nèi)缺氧對(duì)成年子代大鼠脂肪肝易感性的影響
目的:觀察PH對(duì)子代大鼠肝臟發(fā)育及成年后NAFLD易感性的影響。方法:將妊娠大鼠從妊娠第4天至妊娠第21天(gestation day,GD4-21)放入缺氧環(huán)境飼養(yǎng)(O2濃度10±0.5%),稱量胎鼠(GD21)、成年子代大鼠(6個(gè)月)及子代成年后經(jīng)短期缺氧(7天)大鼠的體重、肝臟重量;分別對(duì)上述
4、樣本肝臟進(jìn)行HE染色和蘇丹Ⅲ染色,光鏡觀察組織形態(tài)學(xué);電鏡觀察胎鼠肝臟的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果:PH可顯著降低胎鼠的體重、肝臟重量及肝重系數(shù),子代成年后這種情況均消失,但子代成年后再經(jīng)短期缺氧刺激,雄性大鼠肝重系數(shù)明顯升高。組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示宮內(nèi)缺氧可使胎鼠肝細(xì)胞質(zhì)成分減少,特別是線粒體數(shù)量減少,嵴固縮,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹斷裂,糖原顆粒增多;成年后表現(xiàn)為細(xì)胞的空泡化。蘇丹Ⅲ染色結(jié)果顯示宮內(nèi)缺氧胎鼠及其成年子代再短期缺氧后,肝臟中有大量脂滴蓄積。結(jié)論:P
5、H能顯著影響胎肝發(fā)育,該影響可與成年后NAFLD易感性增加相關(guān)。
第二部分宮內(nèi)缺氧增加子代大鼠脂肪肝易感性的機(jī)制研究
目的:探討PH增加子代大鼠成年NAFLD易感性的胰島素信號(hào)通路機(jī)制,及PH對(duì)肝臟RAS的影響。方法:分別檢測(cè)胎鼠、成年子代大鼠及成年子代再經(jīng)短期缺氧大鼠的空腹血糖、血漿胰島素及甘油三酯、總膽固醇水平,并計(jì)算胰島素敏感性系列指數(shù);檢測(cè)其肝臟胰島素信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平;檢測(cè)其血漿和肝組織勻漿中血
6、管緊張素Ⅰ(angiotoninⅠ,AngⅠ)、血管緊張素Ⅱ(angiotoninⅡ,AngⅡ)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)水平。結(jié)果:PH可導(dǎo)致胎鼠胰島β細(xì)胞功能受損,血漿胰島素水平下降,機(jī)體胰島素敏感性增高,肝臟胰島素信號(hào)通路蛋白表達(dá)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(glucose transporters2,Glut2)增加,血糖降低;子代成年后胰島素敏感性降低,肝臟胰島素信號(hào)通路蛋白
7、表達(dá)明顯低于正常子代;PH成年子代再缺氧后,血糖顯著增高,胰島素敏感性降低更為明顯,肝臟胰島素信號(hào)通路蛋白表達(dá)雖因缺氧應(yīng)激而增高,但增高幅度顯著低于正常子代,且Glut2甚至較缺氧刺激前顯著下降;PH胎鼠及成年子代大鼠與正常對(duì)照組比較血漿AngⅠ、AngⅡ、ACE水平無(wú)顯著差異,而肝臟中AngⅡ含量顯著增加;成年子代再經(jīng)缺氧刺激后,PH大鼠血漿AngⅡ含量、肝臟中AngⅠ、AngⅡ含量均顯著增高,肝臟中的ACE含量也顯著高于缺氧前和正常
8、子代缺氧后。結(jié)論:引起子代大鼠成年IR是PH增加子代NAFLD易感性的機(jī)制之一。成年后的IR恰恰是其胎兒期胰島素敏感性增高的“印跡”效應(yīng)。PH可使子代肝臟組織局部RAS激活,循環(huán)RAS對(duì)缺氧刺激敏感性增高。
第三部分缺氧對(duì)原代培養(yǎng)胎羊肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的影響及RAS在其胰島素信號(hào)通路中的作用機(jī)制
目的:觀察缺氧對(duì)原代培養(yǎng)胎羊肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和其胰島素信號(hào)通路的影響及RAS在其中的作用。方法:采用臍靜脈Ⅳ型膠原酶灌注法
9、和Percoll梯度離心法分離胎羊肝細(xì)胞并進(jìn)行原代培養(yǎng),利用免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞性狀和純度。繪制原代培養(yǎng)胎羊肝細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線,選擇最佳實(shí)驗(yàn)時(shí)間。用免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞AT1、AT2的存在、分布、豐度。建立肝細(xì)胞缺氧損傷模型,利用細(xì)胞計(jì)數(shù)法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)缺氧對(duì)胎羊肝細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期及凋亡的影響;利用透射電鏡觀察缺氧對(duì)胎肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響;檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中AngⅠ、AngⅡ、ACE含量。將AngⅡ、Losartan(AT1
10、阻斷劑)、PD123319(AT2阻斷劑)分別作用于缺氧處理和正常對(duì)照胎羊肝細(xì)胞,利用Western-blot方法檢測(cè)肝細(xì)胞胰島素信號(hào)通路的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:經(jīng)過(guò)鑒定,確定我們成功分離和培養(yǎng)了純度>95%的胎羊肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞,其細(xì)胞膜上普遍具有豐富的AngⅡ受體AT1和AT2。缺氧可使原代培養(yǎng)的胎肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞S期細(xì)胞比率和細(xì)胞增殖指數(shù)增高,同時(shí)凋亡細(xì)胞比率也隨缺氧時(shí)間而遞增;缺氧24h后細(xì)胞數(shù)量逐步下降。缺氧組原代培養(yǎng)胎羊肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的線粒體
11、腫脹、基電子密度高,嵴排列紊亂固縮,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,胞漿內(nèi)現(xiàn)大量脂滴。缺氧細(xì)胞培養(yǎng)基中AngⅠ、AngⅡ較正常組均顯著升高,ACE含量無(wú)差異。缺氧組原代培養(yǎng)胎羊肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與正常對(duì)照組比較,胰島素信號(hào)通路蛋白均降低,而Glut2表達(dá)略有增加趨勢(shì)。阻斷AT1或阻斷AT2后,胰島素信號(hào)通路蛋白表達(dá)均進(jìn)一步下降,Glut2表達(dá)也明顯下降,且阻斷AT1組下降幅度大于加入阻斷AT2組;加入AngⅡ(同時(shí)興奮AT1和AT2)的原代培養(yǎng)胎羊肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞胰島素
12、信號(hào)通路蛋白均顯著增高,Glut2表達(dá)顯著增加;單獨(dú)興奮AT2和單獨(dú)興奮AT1,胰島素信號(hào)通路蛋白和Glut2表達(dá)的量增加,但均無(wú)同時(shí)興奮AT1/AT2增加顯著。結(jié)論:原代培養(yǎng)高純度的胎羊肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞保持了原有細(xì)胞特性。缺氧可誘導(dǎo)胎肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖,以代償由于缺氧而損失(凋亡或壞死)的細(xì)胞,同時(shí)引起細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷及AngⅠ、AngⅡ分泌增加。RAS參與了PH導(dǎo)致的胎肝代謝異常及胰島素信號(hào)通路激活,該過(guò)程由AT1和AT2協(xié)同作用,AT1占主
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