川芎嗪等4種成分對ANGⅡ誘導(dǎo)的大鼠VAF增殖及膠原蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)(PTCA)已經(jīng)成為冠心病患者的主要治療手段之一,然而PTCA術(shù)后的高再狹窄(RS)率,嚴(yán)重影響了心臟介入治療的遠(yuǎn)期療效。RS形成的病理機(jī)制還不十分清楚,有充足的證據(jù)表明,血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)、血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)、血管外膜成纖維細(xì)胞(VAF)、其他血管壁細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)均參與了RS的形成。傳統(tǒng)認(rèn)為血管外膜僅僅起支持和營養(yǎng)作用的觀點(diǎn)受到質(zhì)疑,它也積極參與了血管損傷后的一系列應(yīng)激反應(yīng)。
　　

2、 近年來提出的血管重塑(VR)學(xué)說,認(rèn)為不利的VR可能是引起RS的重要因?yàn)?VAF在血管損傷情況下迅速增殖、活化、分泌膠原參與血管的生理或病理性修復(fù)過程。VAF的一系列變化促進(jìn)血管外膜纖維化,像收縮的瘢痕一樣,縮窄受損的血管,導(dǎo)致管腔狹窄,參與再狹窄的形成。
　　 中醫(yī)藥在心血管疾病防治方面有著悠久歷史和獨(dú)特優(yōu)勢,臨床研究表明活血化瘀類方藥對防治PTCA術(shù)后RS形成具有良好的療效。中藥作用機(jī)制復(fù)雜,具有多途徑多靶點(diǎn)整合作用的特點(diǎn)

3、,研究發(fā)現(xiàn)活血化瘀類中藥通過多方面機(jī)制發(fā)揮效應(yīng),包括:抑制血小板活化,抗血栓形成,拮抗鈣離子,抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性,抑制VSMC增殖及抑制炎癥反應(yīng)等。
　　 VAF的特性及其在RS過程中發(fā)生的生物學(xué)行為改變使其成為RS防治的潛在靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以此為著眼點(diǎn),對VAF在血管損傷中的刺激因素作用下的變化進(jìn)行觀察,選取4種具有代表性的活血化瘀中藥進(jìn)行研究,觀察其主要成分對前述病理過程的干預(yù)或逆轉(zhuǎn)作用。為更深入揭示中藥作用機(jī)理做一些有益

4、嘗試,提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 本實(shí)驗(yàn)探討了4種經(jīng)臨床證實(shí)藥效明確的活血化瘀中藥川芎、葛根、丹參、丹皮的主要成份鹽酸川芎嗪(tetramethylpyrazine),葛根素(puerarin),丹參酮ⅡA(tanshinoneⅡ A),丹皮酚(paeonol)對血管緊張素Ⅱ(ANGⅡ)誘導(dǎo)的VAF增殖及膠原蛋白表達(dá)的影響。主要研究內(nèi)容分為如下三部分:
　　 一大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)、鑒定及生物學(xué)行為研究
　　

5、 本實(shí)驗(yàn)采用組織塊貼壁法,建立了大鼠胸主動(dòng)脈VAF的原代培養(yǎng)方法。采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對細(xì)胞進(jìn)行鑒定,并進(jìn)行了細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察和生物學(xué)特性研究,采用MTT法測定細(xì)胞活力,間接反映細(xì)胞生長狀況。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)組織塊干涸貼壁,高營養(yǎng)培養(yǎng)基(含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)進(jìn)行誘導(dǎo),有利于細(xì)胞迅速萌出,0.25％胰酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代,常規(guī)培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)維持培養(yǎng),細(xì)胞可迅速增殖,成典型的放射狀排列走行,

6、在第2～4d進(jìn)入指數(shù)生長期。這樣培養(yǎng)的VAF性狀穩(wěn)定,生長狀態(tài)良好,純度高,可傳至7～8代。中間絲蛋白是細(xì)胞骨架蛋白的一種,具有組織特異性,常用來鑒別細(xì)胞的組織來源。采用間質(zhì)性來源的波形蛋白(Vimentin),肌性來源的結(jié)蛋白(desmin)和內(nèi)皮性來源的第Ⅷ因子(vWF)進(jìn)行細(xì)胞的免疫化學(xué)染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Vimentin染色陽性,鑒定細(xì)胞為間質(zhì)組織來源,而desmin和vWF染色陰性,排除了其肌源性細(xì)胞和內(nèi)皮來源細(xì)胞的可能。
　

7、　 本方法簡便,實(shí)驗(yàn)周期短,可操作性強(qiáng),為相關(guān)血管性疾病的體外研究創(chuàng)造了條件。二鹽酸川芎嗪、葛根素、丹參酮ⅡA、丹皮酚對正常及ANGⅡ誘導(dǎo)的VAF增殖的影響
　　 本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖敲鼷}酸川芎嗪、葛根素、丹參酮ⅡA、丹皮酚的最大無毒劑量,并觀察它們在無毒劑量范圍內(nèi)對正常VAF增殖的影響,在此基礎(chǔ)上以ANGⅡ?yàn)榇碳ひ蛩?模擬血管損傷時(shí)對VAF的影響,進(jìn)一步研究這些中藥單體成分對病理狀態(tài)下細(xì)胞異常增殖的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)取第3

8、代原代培養(yǎng)的VAF,以不同濃度梯度的4種中藥單體成分作用于細(xì)胞,MTT法測定細(xì)胞的活性,并觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽酸川芎嗪在4.0×10-3mol·L-1,葛根素在2.0×10-3mol·L-1,丹參酮ⅡA在2.0×10-3mol·L-1,丹皮酚在4.0×10-3mol·L-1時(shí)對細(xì)胞無明顯毒性作用,與正常對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),因此確定它們?yōu)樽罡呓o藥濃度。
　　 選取以下濃度:鹽酸川芎嗪:2.0×10-5

9、,1.0×10-4,5.0×10-4,2.0×10-3,4.0×10-3mol·L-1；葛根素:5.0×10-6,2.0×10-5,1.0×10-4,5.0×10-4,2.0×10-3mol·L-1；丹參酮ⅡA:1.0×10-7,4.0×10-7,2.0×10-6,1.0×10-5,2.0×10-5mol·L-1；丹皮酚:2.0×10-5,1.0×10-4,5.0×10-4,2.0×10-3,4.0×10-3mol·L-1作用于細(xì)胞,采

10、用MTT法測定細(xì)胞的活性,連續(xù)觀察5d,進(jìn)行藥物對正常細(xì)胞增殖作用的考察,做時(shí)效、量效曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這4種單體成分對正常VAF的增殖隨時(shí)間延長逐漸表現(xiàn)出一定的抑制增殖作用(P<0.05或P<0.01),但在短期內(nèi)無明顯作用(P>0.05),除葛根素外,其他各成分的抑制作用均顯示出一定的量效關(guān)系。
　　 采用ANGⅡ作為刺激因素,證實(shí)其具有刺激VAF增殖的作用,并對ANGⅡ的最佳刺激濃度進(jìn)行了摸索,MTT法測定細(xì)胞增殖活力,結(jié)果發(fā)

11、現(xiàn)以1×10-7mol·L-1ANGⅡ刺激24h后細(xì)胞增殖效應(yīng)最明顯,與正常細(xì)胞對照組比較呈現(xiàn)顯著差異(P<0.01),因此采用1×10-7mol·L-1為造模濃度。
　　 在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,觀察川芎嗪等4種成分對ANGⅡ誘導(dǎo)的VAF增殖的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種單體成分作用于細(xì)胞24h后,均能顯著抑制ANGⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞異常增殖,與模型組比較差異顯著(P<0.05或P<0.01),并且呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。
　　 本實(shí)驗(yàn)說明這4

12、種活血化瘀中藥單體成分對正常VAF增殖的作用緩慢而溫和,對刺激因素作用下的VAF的異常增殖具有迅速、顯著的抑制作用,推測這些單體成分抑制病理性VAF增殖是其抑制血管再狹窄的作用機(jī)制之一。
　　 三鹽酸川芎嗪、葛根素、丹參酮ⅡA、丹皮酚對ANGⅡ誘導(dǎo)的VAF膠原蛋白表達(dá)的影響
　　 合成膠原蛋白是VAF的特性,在某些刺激因素作用下,細(xì)胞表達(dá)膠原蛋白增多。本實(shí)驗(yàn)以ANGⅡ?yàn)榇碳ひ蛩?觀察川芎嗪等4種成分對ANGⅡ誘導(dǎo)的VAF

13、膠原蛋白表達(dá)的影響。
　　 原代培養(yǎng)的第3代VAF用1×10-7mol·L-1ANGⅡ予以刺激,分別加入如下濃度的4種單體成分:鹽酸川芎嗪:2.0×10-5,1.0×10-4,5.0×10-4,2.0×10-3,4.0×10-3mol·L-1;葛根素:5.0×10-6,2.0×10-5,1.0×10-4,5.0×10-4,2.0×10-3mol·L-1；丹參酮ⅡA:1.0×10-7,4.0×10-7,2.0×10-6,1.0×1

14、0-5,2.0×10-5mol·L-1；丹皮酚:2.0×10-5,1.0×10-4,5.0×10-4,2.0×10-3,4.0×10-3mol·L-1,與ANGⅡ共同作用于細(xì)胞48h,測定細(xì)胞培養(yǎng)液中羥脯氨酸含量來間接反映VAF分泌的膠原含量。結(jié)果顯示:ANGⅡ在1×10—7mol·L-1時(shí),能明顯刺激VAF分泌膠原,與正常細(xì)胞對照組比較有顯著差異(P<0.01)。這些單體成分對ANGⅡ誘導(dǎo)的VAF分泌膠原增多有顯著的抑制作用,與模型組

15、比較有顯著差異(P<0.05或P<0.01),并呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。
　　 在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用蛋白免疫印跡法(Western Blotting)檢測ANGⅡ刺激下的VAFⅠ型膠原蛋白的前體procollagenⅠ的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)采用1×10-7mol·L-1作為ANGⅡ刺激濃度,以四種成分的最大無毒濃度:鹽酸川芎嗪:4.0×10—3mol·L-1；葛根素:2.0×10-3mol·L-1；丹參酮ⅡA:2.0×10-5mol·L-1

16、；丹皮酚:4.0×10-3mol·L-1,與ANGⅡ共同作用于細(xì)胞48h,結(jié)果顯示ANGⅡ能明顯刺激procollagenⅠ的表達(dá),與正常對照組比較差異顯著(P<0.01),而4種單體成分均能抑制ANGⅡ的這種作用,與模型組比較差異顯著(P<0.01),以丹參酮ⅡA抑制作用最明顯。
　　 本實(shí)驗(yàn)首先探討了川芎嗪等4種中藥單體成分對VAF分泌膠原的影響,發(fā)現(xiàn)它們抑制VAF膠原分泌呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系,進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明它們對Ⅰ型膠原蛋白