體外激活的免疫增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)于放化療所導(dǎo)致骨髓抑制的恢復(fù)作用.pdf

1、背景： 目前惡性腫瘤已成為嚴(yán)重危害人類健康的疾病，在現(xiàn)階段常規(guī)的臨床治療惡性腫瘤過程中，大部分患者曾接受或即將接受放療及化療。但惡性腫瘤患者接受放化療后，特別在長(zhǎng)期多個(gè)化療周期后或大劑量化療之后，由于臨床使用的抗腫瘤藥物均有不同程度的毒副作用，即藥物治療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常的組織也有一定的損害，尤其常常出現(xiàn)不同程度的骨髓功能抑制，通常是先出現(xiàn)白細(xì)胞減少，然后出現(xiàn)血小板降低，部分患者甚至出現(xiàn)貧血癥狀，而骨髓抑制的出現(xiàn)使得治

2、療無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行，故導(dǎo)致治療失敗。嚴(yán)重的粒細(xì)胞、血小板減少可分別輸注粒細(xì)胞和血小板，嚴(yán)重的貧血可輸注紅細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)促紅細(xì)胞生成素(EPO)。除此之外，目前常用的G-CSF，GM-CSF，促紅素以及IL-11。對(duì)輕微及中等程度的骨髓抑制情況有效果，但對(duì)于嚴(yán)重或長(zhǎng)期慢性的骨髓抑制往往無(wú)效[1-4]。探索刺激廣譜造血功能恢復(fù)的治療方法，在臨床工作中非常需要。我們摸索了一種通過注射體外激活免疫細(xì)胞的細(xì)胞免疫治療方法，在放化療所致骨髓抑制的小鼠模型及

3、12例臨床病例取得良好的治療效果。 第一部分體外激活的免疫增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)于放化療所導(dǎo)致骨髓抑制的恢復(fù)作用 (實(shí)驗(yàn)研究) 目的：通過給予放化療導(dǎo)致的骨髓抑制小鼠注射體外激活的免疫細(xì)胞，比較不同注射時(shí)間、不同注射細(xì)胞數(shù)量對(duì)骨髓抑制的治療作用，觀察治療前后血細(xì)胞數(shù)、骨髓像、外周血干細(xì)胞勁員情況的變化以及激活免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，研究分析其治療嚴(yán)重骨髓抑制的恢復(fù)作用的可能機(jī)制。方法：(1)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果給予小鼠腹腔內(nèi)注射1

4、.5mg卡鉑后立即給予250cGY的6MV直線加速器的全身照射建立骨髓抑制模型，按照不同的免疫細(xì)胞、不同注射時(shí)間及注射濃度分組，另設(shè)陰性處理組和空白對(duì)照組；(2)分離正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞和正常BALB/c小鼠脾臟細(xì)胞，分別進(jìn)行體外培養(yǎng)并激活；(3)觀察小鼠存活情況，比較不同注射時(shí)間之間、不同注射細(xì)胞數(shù)量之間、治療組與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組之間的存活率；觀察治療組治療前后血細(xì)胞數(shù)變化；檢測(cè)免疫細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子情況；HE染色光鏡下觀察

5、治療前后骨髓像變化情況；流式細(xì)胞儀分析比較人免疫激活細(xì)胞與rhG-CSF對(duì)小鼠外周血干細(xì)胞動(dòng)員情況。結(jié)果：(1)激活人白細(xì)胞預(yù)防組與處理組生存率分別為30％和90％，激活小鼠脾臟細(xì)胞預(yù)防組和處理組生存率分別為20％和100％。預(yù)防組與處理組比較P值分別為0.010和0.010，差異均顯著。(2)注射濃度為1×107細(xì)胞數(shù)的激活人白細(xì)胞注射組與陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組的生存率分別為90％、20％和20％，注射濃度為1×107細(xì)胞數(shù)的激活小鼠

6、脾臟細(xì)胞注射組與陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組的生存率分別為90％、10％和20％。三組之間比較P值分別為0.001和0.000，差異非常顯著。(3)不同濃度(分別注射1×105、1×106、1×107個(gè)細(xì)胞/只/次)的激活人白細(xì)胞處理組的生存率分別為80％、90％和100％；不同濃度(分別注射1×105、1×106、1×107個(gè)細(xì)胞/只/次)的激活小鼠脾臟細(xì)胞處理組的生存率分別為80％、90％和100％，各組之間比較P值分別為0.224和0.

7、760，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著。(4)激活人白細(xì)胞處理組(1x107個(gè)細(xì)胞/次/只)與激活小鼠脾臟細(xì)胞處理組(1x107個(gè)細(xì)胞/次/只)間比較P值0.500，無(wú)顯著差異。(5)血細(xì)胞計(jì)數(shù)：處理后不同時(shí)間所計(jì)白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)和血小板數(shù)經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差分析檢驗(yàn)，F(xiàn)值分別為55.577、56.593和96.517，P值均小于0.001，差異顯著。(6)細(xì)胞因子：檢測(cè)到的19個(gè)細(xì)胞因子當(dāng)中，有7個(gè)(IL-1b，IL-2，IL-6，IL-8，G-CSF

8、，GM-CSF，MIP-1b)為較高分泌水平，9個(gè)(IL-4，IL-5，IL-10，IL-13，IL-17，IL-18，IFN-γ及MCP-1)為中等水平。而剩余3個(gè)(IL-7，IL-12andEotaxin)為非常低的分泌水平。(7)骨髓像檢查：在卡鉑及放射作用后2周，小鼠骨髓受到嚴(yán)重抑制，骨髓細(xì)胞破壞嚴(yán)重。骨髓像顯示“一片荒涼”。殘留的生發(fā)中心孤立分布。骨髓細(xì)胞數(shù)少于25％，大多數(shù)骨髓細(xì)胞為成熟的淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞。只有極少數(shù)細(xì)胞處于

9、分化成熟期。而治療開始后6周的骨髓像顯示骨髓血細(xì)胞明顯增多并且分布于細(xì)胞分裂的各個(gè)期。治療組細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析也可發(fā)現(xiàn)骨髓中細(xì)胞數(shù)明顯增多，各系細(xì)胞都得到恢復(fù)。(8)外周血干細(xì)胞動(dòng)員：通過檢測(cè)及記數(shù)外周血CD34+細(xì)胞，我門發(fā)現(xiàn)所采用的免疫治療對(duì)提升CD34+細(xì)胞具有持續(xù)性及可重復(fù)性，相對(duì)于使用G-CSF動(dòng)員小鼠外周血CD34+細(xì)胞的效果更好。結(jié)論：通過注射經(jīng)過體外激活的免疫細(xì)胞能顯著增加骨髓抑制模型小鼠的存活率，用于治療骨髓抑制的療效滿意

10、。其可能的治療機(jī)制是：激活的免疫細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子促進(jìn)了骨髓各系造血過程的恢復(fù)。 第二部分體外激活的免疫增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)于放化療所導(dǎo)致骨髓抑制的恢復(fù)作用 (臨床觀察)目的：在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，探索在臨床工作中運(yùn)用體外激活的免疫細(xì)胞治療長(zhǎng)期接受放化療患者出現(xiàn)長(zhǎng)期慢性骨髓抑制的療效。方法：(1)入組條件：該研究中的患者均為進(jìn)展期的血液腫瘤或晚期已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶的惡性實(shí)體瘤患者。進(jìn)入本治療前，入組患者均經(jīng)過高強(qiáng)度化療或長(zhǎng)期的多

11、周期的化療，其中部分患者并接受過放射治療，入組患者處于嚴(yán)重的骨髓抑制狀態(tài)。并且接受過G-CSF，促紅細(xì)胞生成素，與IL-11的聯(lián)合治療至少2周而未能恢復(fù)。在這個(gè)開放性的非隨機(jī)性的臨床研究當(dāng)中，總?cè)虢M患者為12人。(2)人外周血單個(gè)核細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)：異基因的粒細(xì)胞來(lái)自健康供者，其ABO血型相匹配。利用Ficoll-Hypaque分離機(jī)采集分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)。分離出的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)加入IL-2、GM-CSF以及鈣離子載體A

12、23187最大激活單核細(xì)胞及T細(xì)胞.(3)注射激活的免疫細(xì)胞：患者接受的激活免疫細(xì)胞數(shù)量為5x107細(xì)胞/日.于0，1，2三日回輸.3-7日休息恢復(fù).這種每周治療3日，休息4日的周期重復(fù)4周.如果治療過程中血小板數(shù)達(dá)到40，000/mL時(shí)，治療亦可停止。在治療以外的時(shí)間對(duì)血中的血小板進(jìn)行檢測(cè)，每周3次。當(dāng)檢測(cè)到血小板數(shù)達(dá)到40，000/mL時(shí)，繼續(xù)監(jiān)測(cè)3次。在本研究過程當(dāng)中入組患者不可以使用任何細(xì)胞因子以防對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生誤導(dǎo)。(4)數(shù)據(jù)

13、采集和分析：觀察細(xì)胞培養(yǎng)激活情況；取細(xì)胞培養(yǎng)激活后5天的培養(yǎng)上清進(jìn)行細(xì)胞因子的檢測(cè)；對(duì)患者血小板和粒細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)以觀察其恢復(fù)情況；觀察治療過程中的不良反應(yīng)。結(jié)果：(1)外周血單個(gè)核細(xì)胞生長(zhǎng)情況：在2日的培養(yǎng)過程中，部分細(xì)胞生長(zhǎng)情況良好。這些細(xì)胞在GM-CSF，IL-2，以及鈣離子載體的作用下不斷擴(kuò)增。但同時(shí)也有對(duì)刺激物無(wú)反應(yīng)的細(xì)胞最終死亡。我們觀察細(xì)胞膜的變化，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)前及培養(yǎng)后其變化不大。(2)血小板的恢復(fù)：10位長(zhǎng)期嚴(yán)重的血小板減

14、少癥患者對(duì)該項(xiàng)治療有反應(yīng)，治療后其血小板記數(shù)高于40，000/mL。其余2位患者對(duì)該治療無(wú)反應(yīng)。在血小板計(jì)數(shù)得到改善的10位患者當(dāng)中，2位接受過3次治療；3位接受過6次治療；3位接受過9次治療；還有2位接受過12次治療。(3)粒細(xì)胞恢復(fù)：實(shí)驗(yàn)組患者中有6位同時(shí)表現(xiàn)為粒細(xì)胞低下。盡管曾接受過高強(qiáng)度的G-CSF治療，其粒細(xì)胞仍然底于正常。但經(jīng)過激活免疫細(xì)胞治療后，所有6位粒細(xì)胞低下患者其粒細(xì)胞記數(shù)均明顯提高并恢復(fù)至正常水平。本研究發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞

15、的恢復(fù)較血小板恢復(fù)要早。在嚴(yán)重的骨髓抑制患者粒細(xì)胞的恢復(fù)早于血小板恢復(fù)一至數(shù)周。入組治療患者當(dāng)中有2例血小板未能像粒細(xì)胞一樣得到改善。初步觀察表明，相對(duì)于粒細(xì)胞而言，血小板的恢復(fù)需經(jīng)過更多次的治療及更長(zhǎng)的治療時(shí)間。(4)細(xì)胞因子分析：檢測(cè)到的主要細(xì)胞因子為IL-1b，IL-2，IL-6，IL-8，G-CSF，GM-CSF，MIP-1b，IL-4，IL-5，IL-10，IL-13，IL-17，IL-18，IFN-gamma，及MCP-1等