輻射導致長期骨髓抑制的機制及MnTE骨髓輻射保護作用的試驗觀察.pdf

1、目的:電離輻射(ionizing radiation,IR)不僅引起急性組織損傷,也可導致長期的組織損傷,如長期骨髓抑制(long—term bone marrow depression)。導致長期骨髓抑制的主要原因是IR誘導的造血干細胞(hematopoietic stem cells,HSCs)衰老。然而,目前不僅IR引起HSCs衰老的分子機制尚未闡明,而且臨床上也缺乏治療長期骨髓抑制的有效手段。本課題對輻射導致的長期骨髓抑制的機制

2、進行了深入研究,并探討超氧化物歧化酶模擬化合物MnTE對骨髓長期抑制的治療作用,為開發(fā)新的治療長期骨髓抑制的藥物提供實驗基礎。
　　 方法:8-10周雄性C57BL/6-Ly-5.2小鼠分為對照組、照射組(亞致死劑量6.5Gy TBI)和照射后給藥組(NADPH氧化酶抑制劑DPI；抗氧化劑MnTE)。給藥2個月后取小鼠骨髓,進行以下分析:梯度離心分離小鼠骨髓單個核細胞(bone marrowmononuclear cells,B

3、M-MNCs),進行在體HSCs競爭抑制試驗(competitiverepopulation assay)；BM-MNCs在MethoCult M3434 methylcellulose培養(yǎng)基中培養(yǎng),11天后收取單個CFU—GEMM集落進行細胞遺傳學分析；流式細胞儀分選造血干細胞(hematopoietic progenitor cells,HSCs；或者lin-Sca-1+cKit+,LSK-)、造血祖細胞(lin-Sca-1-cKi

4、t+,hematopoietic progenitor cells,HPCs)(LSK+),測定兩群細胞內活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平;8-羥基-脫氧鳥嘌呤核苷(8-hydroxydeoxyguanine,8-OH-dG)及γ-H2AX免疫熒光染色檢測DNA氧化損傷和DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks,DSBs)；細胞集落形成試驗(Colony-forming cell as

5、say),Cobblestone Area—Forming Cell assay(CAFC)試驗和單細胞CAFC分析檢測兩群細胞的集落形成能力； Annexin V/PI細胞染色流式細胞儀分析細胞凋亡(apoptosis)；半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT—PCR)技術檢測兩群細胞中NADPH氧化酶(NADPH oxidases,NOX),包括NOX1,NOX2,NOX3和NOX4及P16和p53表達水平,并對兩群細胞行NOX3和NOX4

6、免疫熒光染色。
　　 結果:在輻射導致骨髓損傷的氧化機制研究中,我們首次發(fā)現(xiàn)小鼠接受亞致死劑量全身照射(6.5Gy TBI)后,其造血祖細胞(HPCs)內ROS短暫性升高,之后迅速下降至正常水平；而HSCs內活性氧持續(xù)維持在高水平,即處于長期氧化應激狀態(tài)。TBI誘導的HSCs的慢性氧化應激與持續(xù)存在的DNA氧化損傷、DNA雙鏈斷裂、HSCs集落形成能力降低及HSCs衰老密切相關,但與細胞凋亡無關。進一步研究發(fā)現(xiàn),TBI所誘導的H

7、SCs長期氧化損傷主要是通過NOX4表達的上調介導的,TBI照射引起HSCs NOX4表達升高,照射后給予diphenylene iodonium(特異性抑制NOXs表達),抑制了NOXs的活性可明顯降低TBI誘導HSCs內活性氧的增加,也可減輕DNA氧化損傷和減少DNA雙鏈斷裂,并明顯提高HSCs的集落形成能力。這些研究結果首次直接證明輻射可能部分通過上調NOX4而選擇性提高HSCs慢性氧化應激水平,誘導HSCs衰老,最終導致長期骨髓

8、抑制。
　　 為了有效預防和治療核輻射暴露或接受放射治療患者的長期骨髓抑制,基于TBI誘導HSCs慢性氧化應激導致長期骨髓抑制的機制,我們試圖尋找新的抗氧化劑,治療TBI誘導的長期骨髓抑制。Mn(Ⅲ)meso-tetrakis(N-ethylpyridinium-2-yl)porphyrin(MnTE)是一種超氧化物歧化酶模擬化合物,我們應用上述TBI小鼠模型檢測了MnTE對長期骨髓抑制的治療作用。結果發(fā)現(xiàn),照射后使用MnTE可

9、明顯抑制TBI所致的HSCs、造血祖細胞活性氧生成和DNA氧化損傷。HSCs內氧化應激水平下降與骨髓中的HSCs數(shù)量增加和功能改善有關。照射后使用MnTE治療小鼠的HSCs功能與未照射作為對照小鼠的HSCs的功能已無明顯差異,提示MnTE治療可抑制TBI造成的HSCs功能損傷。照射后使用MnTE治療對輻射造成的HSCs保持休眠或靜止能力及增殖分化能力損傷具有保護作用,對TBI小鼠HSCs壽命縮短有改善作用。進一步研究發(fā)現(xiàn),MnTE治療可

10、降低TBI誘導的HSCs中p16 mRNA的表達水平,提示MnTE治療抑制了TBI誘導的HSCs的衰老,在體內競爭性移植試驗中,MnTE治療明顯改善照射后小鼠HSCs長期再植能力和多系細胞造血重建能力。
　　 結論:輻射誘導造血干細胞損傷機制研究發(fā)現(xiàn):TBI選擇性誘導HSCs內持續(xù)性ROS升高；HSCs內ROS的持續(xù)升高部分是通過NOX4表達上調介導；TBI所誘導的HSCs慢性氧化應激可通過上調p16導致HSCs喪失自我更新能力