丹參毛狀根中酚酸類和酮類成分合成途徑中bHLH和WD40轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控.pdf

1、丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）是我國傳統(tǒng)中草藥，由于其對心腦血管疾病的預(yù)防和治療效果顯著而被廣泛關(guān)注。丹參中含丹酚酸和丹參酮，為其藥效成分，由于需求量的增大，丹參藥材品質(zhì)也越來越受到重視，對于如何增加丹參巾有效成分含量，進而提高丹參藥材品質(zhì)已然成為當(dāng)下研究熱點。本研究以丹參毛狀根為材料，對丹參酚酸類及丹參酮類成分的代謝調(diào)控機制進行了探討。
　　1.利用終濃度為15μmol·L-1銀離子（Ag+）和100

2、μmol·L-1茉莉酸甲酯(MeJA)兩種誘導(dǎo)子分別對培養(yǎng)18天的丹參毛狀根進行誘導(dǎo)處理，分別在處理后第1、2、3、6、9天采集樣品;利用高效液相色譜(HPLC)對毛狀根中丹酚酸類和丹參酮類成分含量進行檢測，并采用實時定量PCR(RT-qPCR)對丹參酚酸類和丹參酮類成分代謝途徑上關(guān)鍵酶基因表達進行檢測。結(jié)果顯示兩種誘導(dǎo)子處理后，丹參酮和丹酚酸兩類成分含量都發(fā)生了變化，相應(yīng)基因表達也都得到了提高。Ag+顯著增加了迷迭香酸(RA)、阿魏酸

3、和咖啡酸的含量，但對丹參素(DSU)和丹酚酸B(LAB)的生物合成卻起到了抑制作用，總酚酸含量變化不大;而四種丹參酮成分含量全部得到提高，總的丹參酮含量也顯著增加。說明相對于酚酸類成分，丹參酮類成分對于Ag+的誘導(dǎo)更加敏感。經(jīng)MeJA處理后，丹參毛狀根中各種丹酚酸類成分含量顯著增加，特別是RA和LAB，總酚酸含量也明顯提高;對丹參酮Ⅰ(TⅠ)的代謝積累影響不大，并且抑制了丹參酮ⅡA(TⅡA)的生物合成，但是顯著促進了隱丹參酮(CT)和二

4、氫丹參酮Ⅰ(DTⅠ)代謝積累，總的來說對丹參酮類含量影響效果不明顯。Ag+和MeJA處理后丹酚酸類和丹參酮類代謝關(guān)鍵基因表達都受到了影響，說明Ag+和MeJA是通過影響了整個代謝途徑上的相關(guān)基因進而對次生代謝產(chǎn)物合成產(chǎn)生影響。對于丹參酮類代謝途徑來說，MEP途徑對于兩種誘導(dǎo)子的響應(yīng)明顯強于MVA途徑。
　　2.利用同源克隆法及文庫篩選法從丹參中獲得了bHLH和WD40轉(zhuǎn)錄因子的基因序列各4個，分別命名為 SmbHLH7、SmbHL

5、H8、SmbHLH9、SmbHLH10、SmWD40-2、SmWD40-5、SmWD40-6和SmWD40-8。對其序列分析可知分別包含了一個2392bp、675bp、912bp、972bp、1740bp、1026bp、3396bp和1338bp的開放閱讀框，分別編碼636、224、303、323、579、341、114和445個氨基酸。在bHLH的4條氨基酸序列都分別包含1個HLH結(jié)構(gòu)域，說明它們均為bHLH蛋白;而4條WD40的氨基

6、酸序列中全部含有幾個數(shù)目不等的WD-repeat結(jié)構(gòu)域，說明它們屬于WD40轉(zhuǎn)錄因子家族。
　　3.利用克隆得到的4條丹參bHLH和4條WD40轉(zhuǎn)錄因子基因，以及表達載體pCAMBIA-1300(B34)，構(gòu)建過表達重組載體，然后通過發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化體系獲得轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根。成功構(gòu)建出丹參bHLH和WD40轉(zhuǎn)錄因子基因過表達類型毛狀根各4種，并對所獲得毛狀根進行了分子鑒定，證明重組過表達載體成功轉(zhuǎn)化。這為