苦蕎WD40轉錄因子的基因克隆及其對花青素合成的影響.pdf

1、苦蕎(Fagopyrum tataricum)為蓼科蕎麥屬雙子葉禾谷類作物?？嗍w作為一種藥食兩用作物，其最重要的生物活性成分為黃酮，以蘆丁為代表的黃酮醇是其主要儲存形式。然而，在遭受冷和紫外等脅迫時，另外一類黃酮花青素的合成則對苦蕎逆境生理的穩(wěn)定具有重要作用。植物花青素的生物合成在轉錄水平主要受到R2R3-MYB、bHLH和WD40等轉錄因子蛋白單獨或者形成三元復合物的調控，其中轉錄因子WD40更多的是提供平臺促進轉錄因子MYB和bHL

2、H的互作。本研究以“西蕎2號”苦蕎為材料，克隆花青素調控相關轉錄因子FtWD40的cDNA序列，并鑒定其轉錄激活活性;分析花青素和FtWD40基因表達在苦蕎中的組織特異性及其相關性，也分析了在苦蕎逆境脅迫條件下二者變化趨勢間的相關性;進一步通過轉基因技術鑒定FtWD40過表達對煙草花青素合成的影響。本研究可望明確苦蕎轉錄因子FtWD40對在花青素合成途徑中的主要效應基因，加深對苦蕎逆境脅迫中花青素合成調控分子機制的認識。主要取得以下研究

3、結果:
　　1、采用同源克隆法和RACE技術，獲得1條苦蕎WD40基因，命名為FtWD40。FtWD40 ORF框為1035 bp，編碼344個氨基酸殘基，相對分子質量65.9 KDa;聚類分析結果顯示，F(xiàn)tWD40和參與花青素代謝調控的AtTTG1和VvWD等聚為一簇。對花期苦蕎根、莖、葉和花中的花青素含量，以及FtWD40基因表達的測定表明，花青素含量和FtWD40的基因表達量都具有相同的組織特異，均為花＞根＞葉＞莖，二者相關

4、性系數(shù)為r=0.875(P＜0.05)。在冷脅迫和UV-B脅迫下，芽期苦蕎花青素含量與FtWD40基因表達量的相關系數(shù)分別為r=0.785(P＜0.05)和r=0.891(P＜0.05)。以上結果表明，F(xiàn)tWD40可能參與了苦蕎花青素合成的調控。
　　2、構建pBridge-FtWD40真核表達載體，轉化酵母AH109，經(jīng)SD/-Trp/-His雙缺培養(yǎng)篩選獲得陽性轉化子。經(jīng)酵母單雜交系統(tǒng)中的β-半乳糖苷酶活性濾紙分析，結果表明F

5、tWD40蛋白具有轉錄激活活性。
　　3、構建pECMBIA1301-Ft WD40植物表達載體，采用農(nóng)桿菌侵染法轉化煙草愈傷組織，進而對篩選獲得的陽性轉基因煙草中花青素含量及花青素合成途徑中的NtPAL、NtCHS、NtANS、NtDFR、NtFLS和NtF3'H等基因的表達量進行了測定分析。FtWD40轉基因煙草T-1、T-2和T-3株系中的花青素含量分別提高為對照平均的3.45倍、2.81倍和3.24倍(P＜0.01)。同時