楊樹PtoVNS11和PtoMYB156轉錄因子在次生壁形成及類黃酮代謝途徑中的功能分析.pdf

1、苯丙烷代謝途徑是植物次生代謝產物合成中一條重要的生化途徑，該途徑以苯丙氨酸（Phenylalanine）和酪氨酸（Tyrosine）為底物，在苯丙氨酸裂解酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、肉桂酸-4羥化酶（Cinnamate-4-hydroxylase，C4H）等催化下，通過下游特異性分支途徑，分別合成木質素、花青素、丹寧等次生代謝產物。這些次生代謝化合物在植物生長發(fā)育、抵御生物或非生物脅迫中起著重要

2、的作用。比如，木質素作為細胞壁的重要組分，為植物提供機械支撐，并參與病害的防御；而花青素和丹寧等類黃酮化合物則在植物細胞抵御外來非生物脅迫（如紫外輻射）和生物脅迫（如抗病蟲害）中扮演了重要角色。在草本植物中，已經證實苯丙烷代謝途徑受到了NAC、MYB等許多轉錄因子的調控，而該途徑在木本植物的轉錄調控機制研究還相對較少，因此，解析林木中苯丙烷代謝途徑的轉錄調控機制對于闡明木質素及類黃酮等次生代謝產物合成代謝調控機理具有十分重要的意義。

3、r>　　本文以楊樹為研究對象，分別克隆了NAC和MYB家族轉錄因子PtoVNS11和PtoMYB156，對其在調控楊樹次生壁合成和苯丙烷代謝途徑中的生物學功能進行了系統(tǒng)研究，主要結果如下：
　　（一）從毛白楊（Populus tomentosa Carr.）中克隆到一個與擬南芥SND1高度同源的NAC家族轉錄因子編碼基因PtoVNS11。該基因編碼一個由416個氨基酸組成的蛋白，具有NAC家族轉錄因子保守的功能結構域。進化樹分析顯

4、示，該蛋白與擬南芥和毛果楊中調控次生壁合成調控的關鍵轉錄因子SND1和PtrWND1B的序列相似性分別達59.6％和97.9%，而在NAC家族轉錄因子特有結構域（A~E結構域）中的氨基酸序列基本一致。推測PtoVNS11為SND1、PtrWND1B的同源基因，可能具有相似的生物學功能。
　　實時定量PCR分析PtoVNS11基因組織表達譜發(fā)現，該基因在楊樹莖的木質部中特異性表達，暗示其可能參與了對植物次生壁形成的調控。進一步將Pt

5、oVNS11融合GFP構建重組蛋白，亞細胞定位試驗證明，PtoVNS11專一定位于細胞核中。酵母轉錄激活試驗表明，PtoVNS11具有轉錄激活特性。同時，克隆PtoVNS11基因上游2069 bp的啟動子片段，融合GUS報告基因，在轉基因擬南芥中證實，該啟動子能在營養(yǎng)及繁殖器官的維管組織中表達，且啟動子內的SNBE（Secondary Wall NAC Binding Element）元件決定了GUS基因的表達活性，暗示PtoVNS11

6、可能調控了楊樹維管組織的發(fā)育。
　　為了搞清PtoVNS11的生物學功能，將其構建到由組成型表達啟動子驅動的植物表達載體上，首先導入擬南芥 snd1nst1雙突變體中，發(fā)現該基因可恢復雙突變體維管束間纖維及木質纖維形成受阻、莖桿倒伏等缺陷。在擬南芥中過量表達該基因，則引起了木質部細胞和表皮細胞次生壁的異位形成和木質素的過量沉積。上述結果與擬南芥SND1、NST1及PtrWNDs基因的功能相似，證明PtoVNS11是楊樹次生壁形成中

7、木質素合成的“開關”基因。
　　進一步在楊樹中過量表達PtoVNS11，導致轉基因植株莖中木質素含量增加。定量PCR分析顯示，該基因的超表達激活了轉基因楊樹中一系列與次生壁合成相關的NAC/MYB轉錄因子和關鍵酶基因的表達。
　?。ǘ┰诔磉_PtoVNS11的轉基因楊樹中，PtoMYB156的表達水平被明顯下調，進化樹分析發(fā)現PtoMYB156與擬南芥MYB4高度同源，而后者已被證實作為轉錄抑制子參與了擬南芥中木質素合成的

8、調控。因此，推測楊樹中的PtoMYB156是位于PtoVNS11下游的負調控因子，可能參與了楊樹次生壁的生物合成過程。為了解析PtoMYB156轉錄因子的生物學功能，從毛白楊（P.tomentosa Carr.）中克隆了該基因。亞細胞定位試驗證明PtoMYB156定位于細胞核中。啟動子表達特性和實時定量PCR分析顯示，PtoMYB156不僅在毛白楊的莖、根、木質部和莖皮等表達水平較高，而且在葉片及葉柄等組織中含量也比較豐富。酵母單雜交試

9、驗證實PtoMYB156具有轉錄抑制活性。為了進一步研究PtoMYB156的生物學功能，構建了35S:PtoMYB156超表達載體并轉化，獲得毛白楊轉基因超表達株系。利用CRISPR/Cas9靶向基因編輯技術，特異的敲除了毛白楊內源的PtoMBY156編碼基因，獲得了該基因功能缺失的突變體株系。觀察發(fā)現PtoMYB156過量表達引起楊樹倒伏、葉片皺縮上卷，轉基因楊樹莖的直徑、成熟葉葉面積及植株總生物量等相關生長指標下降。在分子水平上，多

10、個次生壁形成相關的關鍵酶基因表達下調。而敲除該基因則導致木質部導管和纖維細胞次生壁厚度增加。同時引起木質素合成鍵酶基因表達顯著上升。以上實驗結果證明PtoMYB156基因參與了楊樹木質素生物合成途徑的調控，進而影響了楊樹次生壁的形成和次生木質部的發(fā)育。
　?。ㄈ榱岁U明 PtoMYB156是否參與了楊樹類黃酮合成途徑中的調控，對PtoMYB156轉基因楊樹中類黃酮合成途徑中關鍵美的表達進行了分子檢測，發(fā)現C4H，CHS，DFR等

11、關鍵酶編碼基因的表達被下調，暗示PtoMYB156可能負調控楊樹中花青素、丹寧等類黃酮化合物的合成。為了進一步驗證PtoMYB156的功能，將其在擬南芥中過量表達，發(fā)現轉基因植株子葉卷曲、體型變小、種子種皮顏色呈淺黃色等表型。DMACA染色顯示轉基因種子中丹寧含量明顯減少。UV-B輻射的抵抗試驗證實轉基因擬南芥的抵御能力減弱。HPLC檢測顯示兩種類黃酮化合物—槲皮素（Quercetin）、山奈酚（Kaempferol）和可溶性丹寧含量均

12、明顯下降。定量PCR分析顯示參與單寧、槲皮素和山奈酚合成的關鍵酶基因表達量均有下調。煙草葉片瞬時共表達試驗證明，PtoMYB156能抑制類黃酮合成途徑關鍵酶LAR、FLS及次生壁合成途徑中相關基因C4H、CesA17、GT43B的表達。上述結果表明，PtoMYB156通過調節(jié)類黃酮化合物的含量，降低了植物對UV-B輻射脅迫的防御能力，影響了擬南芥種皮中色素的累積。
　　綜上所述，本論文克隆了兩個參與楊樹次生壁發(fā)育及類黃酮合成調控的