楊樹(shù)PtoVNS11和PtoMYB156轉(zhuǎn)錄因子在次生壁形成及類黃酮代謝途徑中的功能分析.pdf

1、苯丙烷代謝途徑是植物次生代謝產(chǎn)物合成中一條重要的生化途徑，該途徑以苯丙氨酸（Phenylalanine）和酪氨酸（Tyrosine）為底物，在苯丙氨酸裂解酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、肉桂酸-4羥化酶（Cinnamate-4-hydroxylase，C4H）等催化下，通過(guò)下游特異性分支途徑，分別合成木質(zhì)素、花青素、丹寧等次生代謝產(chǎn)物。這些次生代謝化合物在植物生長(zhǎng)發(fā)育、抵御生物或非生物脅迫中起著重要

2、的作用。比如，木質(zhì)素作為細(xì)胞壁的重要組分，為植物提供機(jī)械支撐，并參與病害的防御；而花青素和丹寧等類黃酮化合物則在植物細(xì)胞抵御外來(lái)非生物脅迫（如紫外輻射）和生物脅迫（如抗病蟲害）中扮演了重要角色。在草本植物中，已經(jīng)證實(shí)苯丙烷代謝途徑受到了NAC、MYB等許多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，而該途徑在木本植物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究還相對(duì)較少，因此，解析林木中苯丙烷代謝途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制對(duì)于闡明木質(zhì)素及類黃酮等次生代謝產(chǎn)物合成代謝調(diào)控機(jī)理具有十分重要的意義。

3、r>　　本文以楊樹(shù)為研究對(duì)象，分別克隆了NAC和MYB家族轉(zhuǎn)錄因子PtoVNS11和PtoMYB156，對(duì)其在調(diào)控楊樹(shù)次生壁合成和苯丙烷代謝途徑中的生物學(xué)功能進(jìn)行了系統(tǒng)研究，主要結(jié)果如下：
　?。ㄒ唬拿讞睿≒opulus tomentosa Carr.）中克隆到一個(gè)與擬南芥SND1高度同源的NAC家族轉(zhuǎn)錄因子編碼基因PtoVNS11。該基因編碼一個(gè)由416個(gè)氨基酸組成的蛋白，具有NAC家族轉(zhuǎn)錄因子保守的功能結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹(shù)分析顯

4、示，該蛋白與擬南芥和毛果楊中調(diào)控次生壁合成調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SND1和PtrWND1B的序列相似性分別達(dá)59.6％和97.9%，而在NAC家族轉(zhuǎn)錄因子特有結(jié)構(gòu)域（A~E結(jié)構(gòu)域）中的氨基酸序列基本一致。推測(cè)PtoVNS11為SND1、PtrWND1B的同源基因，可能具有相似的生物學(xué)功能。
　　實(shí)時(shí)定量PCR分析PtoVNS11基因組織表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，該基因在楊樹(shù)莖的木質(zhì)部中特異性表達(dá)，暗示其可能參與了對(duì)植物次生壁形成的調(diào)控。進(jìn)一步將Pt

5、oVNS11融合GFP構(gòu)建重組蛋白，亞細(xì)胞定位試驗(yàn)證明，PtoVNS11專一定位于細(xì)胞核中。酵母轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn)表明，PtoVNS11具有轉(zhuǎn)錄激活特性。同時(shí)，克隆PtoVNS11基因上游2069 bp的啟動(dòng)子片段，融合GUS報(bào)告基因，在轉(zhuǎn)基因擬南芥中證實(shí)，該啟動(dòng)子能在營(yíng)養(yǎng)及繁殖器官的維管組織中表達(dá)，且啟動(dòng)子內(nèi)的SNBE（Secondary Wall NAC Binding Element）元件決定了GUS基因的表達(dá)活性，暗示PtoVNS11

6、可能調(diào)控了楊樹(shù)維管組織的發(fā)育。
　　為了搞清PtoVNS11的生物學(xué)功能，將其構(gòu)建到由組成型表達(dá)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體上，首先導(dǎo)入擬南芥 snd1nst1雙突變體中，發(fā)現(xiàn)該基因可恢復(fù)雙突變體維管束間纖維及木質(zhì)纖維形成受阻、莖桿倒伏等缺陷。在擬南芥中過(guò)量表達(dá)該基因，則引起了木質(zhì)部細(xì)胞和表皮細(xì)胞次生壁的異位形成和木質(zhì)素的過(guò)量沉積。上述結(jié)果與擬南芥SND1、NST1及PtrWNDs基因的功能相似，證明PtoVNS11是楊樹(shù)次生壁形成中

7、木質(zhì)素合成的“開(kāi)關(guān)”基因。
　　進(jìn)一步在楊樹(shù)中過(guò)量表達(dá)PtoVNS11，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株莖中木質(zhì)素含量增加。定量PCR分析顯示，該基因的超表達(dá)激活了轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)中一系列與次生壁合成相關(guān)的NAC/MYB轉(zhuǎn)錄因子和關(guān)鍵酶基因的表達(dá)。
　?。ǘ┰诔磉_(dá)PtoVNS11的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)中，PtoMYB156的表達(dá)水平被明顯下調(diào)，進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)PtoMYB156與擬南芥MYB4高度同源，而后者已被證實(shí)作為轉(zhuǎn)錄抑制子參與了擬南芥中木質(zhì)素合成的

8、調(diào)控。因此，推測(cè)楊樹(shù)中的PtoMYB156是位于PtoVNS11下游的負(fù)調(diào)控因子，可能參與了楊樹(shù)次生壁的生物合成過(guò)程。為了解析PtoMYB156轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能，從毛白楊（P.tomentosa Carr.）中克隆了該基因。亞細(xì)胞定位試驗(yàn)證明PtoMYB156定位于細(xì)胞核中。啟動(dòng)子表達(dá)特性和實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示，PtoMYB156不僅在毛白楊的莖、根、木質(zhì)部和莖皮等表達(dá)水平較高，而且在葉片及葉柄等組織中含量也比較豐富。酵母單雜交試

9、驗(yàn)證實(shí)PtoMYB156具有轉(zhuǎn)錄抑制活性。為了進(jìn)一步研究PtoMYB156的生物學(xué)功能，構(gòu)建了35S:PtoMYB156超表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化，獲得毛白楊轉(zhuǎn)基因超表達(dá)株系。利用CRISPR/Cas9靶向基因編輯技術(shù)，特異的敲除了毛白楊內(nèi)源的PtoMBY156編碼基因，獲得了該基因功能缺失的突變體株系。觀察發(fā)現(xiàn)PtoMYB156過(guò)量表達(dá)引起楊樹(shù)倒伏、葉片皺縮上卷，轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)莖的直徑、成熟葉葉面積及植株總生物量等相關(guān)生長(zhǎng)指標(biāo)下降。在分子水平上，多

10、個(gè)次生壁形成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因表達(dá)下調(diào)。而敲除該基因則導(dǎo)致木質(zhì)部導(dǎo)管和纖維細(xì)胞次生壁厚度增加。同時(shí)引起木質(zhì)素合成鍵酶基因表達(dá)顯著上升。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明PtoMYB156基因參與了楊樹(shù)木質(zhì)素生物合成途徑的調(diào)控，進(jìn)而影響了楊樹(shù)次生壁的形成和次生木質(zhì)部的發(fā)育。
　?。ㄈ榱岁U明 PtoMYB156是否參與了楊樹(shù)類黃酮合成途徑中的調(diào)控，對(duì)PtoMYB156轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)中類黃酮合成途徑中關(guān)鍵美的表達(dá)進(jìn)行了分子檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)C4H，CHS，DFR等

11、關(guān)鍵酶編碼基因的表達(dá)被下調(diào)，暗示PtoMYB156可能負(fù)調(diào)控楊樹(shù)中花青素、丹寧等類黃酮化合物的合成。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PtoMYB156的功能，將其在擬南芥中過(guò)量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株子葉卷曲、體型變小、種子種皮顏色呈淺黃色等表型。DMACA染色顯示轉(zhuǎn)基因種子中丹寧含量明顯減少。UV-B輻射的抵抗試驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)基因擬南芥的抵御能力減弱。HPLC檢測(cè)顯示兩種類黃酮化合物—槲皮素（Quercetin）、山奈酚（Kaempferol）和可溶性丹寧含量均

12、明顯下降。定量PCR分析顯示參與單寧、槲皮素和山奈酚合成的關(guān)鍵酶基因表達(dá)量均有下調(diào)。煙草葉片瞬時(shí)共表達(dá)試驗(yàn)證明，PtoMYB156能抑制類黃酮合成途徑關(guān)鍵酶LAR、FLS及次生壁合成途徑中相關(guān)基因C4H、CesA17、GT43B的表達(dá)。上述結(jié)果表明，PtoMYB156通過(guò)調(diào)節(jié)類黃酮化合物的含量，降低了植物對(duì)UV-B輻射脅迫的防御能力，影響了擬南芥種皮中色素的累積。
　　綜上所述，本論文克隆了兩個(gè)參與楊樹(shù)次生壁發(fā)育及類黃酮合成調(diào)控的