恐懼應(yīng)激對(duì)大鼠下丘腦單胺類遞質(zhì)、ACTH、CORT、IL-2、IL-8的影響及中藥干預(yù).pdf

1、本課題立足于中醫(yī)七情學(xué)說，采用經(jīng)典條件反射恐懼模型，運(yùn)用電化學(xué)-高效液相法檢測(cè)下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物，放射免疫方法檢測(cè)ACTH、CORT、IL2和IL-8。通過對(duì)邊緣系統(tǒng)三大遞質(zhì)能神經(jīng)元作用的對(duì)比，以及聯(lián)系神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的整體作用，來揭示恐懼發(fā)生的可能機(jī)制及中藥調(diào)節(jié)的深層機(jī)理。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、雄性Wistar大鼠，體重180-220g，隨機(jī)分為三組：正常對(duì)照組、恐懼模型組、孤獨(dú)飼養(yǎng)組，每組8只大鼠

2、?？謶帜Ｐ徒M大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)于不銹鋼籠(50cm×30cm×20cm)中，自由飲食飲水，飼養(yǎng)10天，第11天13:30將大鼠單獨(dú)放入光電刺激儀(30cm×40cm×40cm)，四周為玻璃，底部鋪設(shè)銅柵，通以1mA交流電，頂部置10W日光燈)；前5min為適應(yīng)期，后同時(shí)給予電擊和閃光，每次1S，間隔1min，共30min。第12，13天重復(fù)實(shí)驗(yàn)。第14天實(shí)驗(yàn)只予光照，不予電擊，攝像記錄第6～30min內(nèi)大鼠行為變化，同時(shí)記錄動(dòng)物處于凍結(jié)狀態(tài)的

3、時(shí)間。行為評(píng)定采用盲法，三位觀察者觀看錄像評(píng)分。實(shí)驗(yàn)結(jié)束立即放入曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)，進(jìn)行應(yīng)激后行為學(xué)檢測(cè)。孤獨(dú)飼養(yǎng)組大鼠于同樣環(huán)境下孤獨(dú)飼養(yǎng)13天，第14天13：30攝像記錄大鼠行為變化，并對(duì)其行為學(xué)進(jìn)行評(píng)分，14：00放入曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)，進(jìn)行應(yīng)激后行為學(xué)檢測(cè)。正常對(duì)照組大鼠予以群居飼養(yǎng)，自由飲食飲水，第14天進(jìn)行行為學(xué)測(cè)定及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)第14天，所有動(dòng)物曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)后麻醉，斷頭處死，取血，離心制備血清，肝素抗凝離心制備血漿，-20℃凍存。方法按

4、照放射免疫試劑盒說明進(jìn)行操作，檢測(cè)血漿ACTH水平、血清CORT、IL-2、IL8含量。2、雄性Wistar大鼠，體重180-220g，隨機(jī)分為三組：正常對(duì)照組、恐懼模型組、模型給藥組，每組8只大鼠?？謶帜Ｐ徒M造模方法同前，模型給藥組于電擊實(shí)驗(yàn)前3天桑螵散水煎液灌胃，每日1次，每次2ml，連續(xù)給藥3天。正常動(dòng)物組大鼠群居飼養(yǎng)，自由飲食飲水。實(shí)驗(yàn)第14天，所有動(dòng)物麻醉，斷頭處死，取出下丘腦，勻漿，離心，通過高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC)加電

5、化學(xué)檢測(cè)器(ECD)檢測(cè)單胺類遞質(zhì)及代謝產(chǎn)物含量。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，均用x±s表示，利用Pearson相關(guān)分析曠場(chǎng)兩變量之間的關(guān)系，采用單因素方差分析方法(One-Way-ANOVA)進(jìn)行多樣本均數(shù)比較，若存在差異，采用Levene檢驗(yàn)進(jìn)行方差一致性檢驗(yàn)，若方差齊時(shí)，用Least-significant differerice(LSD)方法，若方差不齊時(shí)用Tamhane’sT2方法。

6、P<0.05被認(rèn)為有顯著性差異。 主要結(jié)果： (一)大鼠行為學(xué)得分及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)行為學(xué)得分恐懼應(yīng)激大鼠的行為得分與正常對(duì)照組及孤獨(dú)飼養(yǎng)組比較均有顯著差異(F=72.582，P=0.000)，恐懼應(yīng)激大鼠行為學(xué)得分高于正常對(duì)照組及孤獨(dú)飼養(yǎng)組。正常對(duì)照組與孤獨(dú)飼養(yǎng)組比較，無顯著差異(P=0.153)。各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平得分、垂直得分、曠場(chǎng)總分均有顯著差異(P<0.01)。水平得分、垂直得分、曠場(chǎng)總分F值分別為23.893、52.3

7、71、40.963：P值均為0.000。恐懼模型組得分低于孤獨(dú)飼養(yǎng)組和正常對(duì)照組，孤獨(dú)飼養(yǎng)組得分高于恐懼模型組，低于正常對(duì)照組(P<0.05)。對(duì)垂直得分及水平得分進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.730，P=0.000(雙側(cè))，認(rèn)為水平得分與垂直得分變量之間存在正相關(guān)關(guān)系。 (二)ACTH、CORT水平比較各組大鼠ACTH、CORT均有顯著差異(F值分別10.466、13.804；均為P<0.01)?？謶帜?/p>

8、型組和正常對(duì)照組血漿ACTH比較，有顯著性差異(P=0.043)；與孤獨(dú)飼養(yǎng)組血漿ACTH比較，有顯著性差異(P=0.010)；恐懼模型組血漿ACTH水平高于正常對(duì)照組及孤獨(dú)飼養(yǎng)組?？謶帜Ｐ徒M和正常對(duì)照組血清CORT有顯著性差異(P=0.000)，與孤獨(dú)飼養(yǎng)組血清CORT比較，亦存在顯著差異(P=0.004)；恐懼模型組CORT水平顯著高于正常對(duì)照組及孤獨(dú)飼養(yǎng)組。孤獨(dú)飼養(yǎng)組與正常對(duì)照組ACTH、CORT比較，無顯著差異(均為P>0.05

9、)。 (三)IL-2、IL-8水平比較各組大鼠IL-2未見顯著差異(F=1.355，P=0.280)，各組大鼠IL-8比較，存在顯著差異(F=3.489，P=0.049)，其中恐懼模型組與正常對(duì)照組IL-8有顯著差異(P=0.015)，恐懼模型組血清IL-8水平高于正常對(duì)照組。孤獨(dú)飼養(yǎng)組IL-8水平與恐懼模型組及正常對(duì)照組相較，均無顯著差異(均為P>0.05) (四)下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量比較恐懼模型組與正常對(duì)照組NE、E、D

10、A、5-HT均有顯著性差異(P值分別為0.022、0.000、0.000、0.023)，恐懼模型組NE、E、DA、5-HT含量均低于正常對(duì)照組；恐懼模型組與模型給藥組在NE、E、5-HT方面存在顯著差異(P值分別為0.001、0.007、0.009)，恐懼給藥組NE、E、5-HT含量均高于恐懼模型組，DA水平兩組未見顯著差異(P=0.104)：正常對(duì)照組與模型給藥組在NE、E、5-HT方面未見顯著差異(P值分別為0.349、0.101、

11、0.459)，DA水平存在顯著差異(P=0.019)。 (五)下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)代謝產(chǎn)物含量比較恐懼模型組與正常對(duì)照組MHPG、HVA存在顯著差異(P值分別為0.004、0.032)，恐懼模型組MHPG、HVA含量低于正常對(duì)照組，DOPAC及5-HIAA兩組間未見顯著差異(P值分別為0.518、0.404)；恐懼模型組與模型給藥組在MHPG、5-HIAA水平有顯著差異(P值分別為0.002、0.005)，DOPAC及HVA兩組間未

12、見顯著差異(P值分別為0.760、0.619)：正常對(duì)照組與模型給藥組在HVA、5-HIAA水平有顯著性差異(P值分別為0.011、0.034)，MHPG及DOPAC兩組間未見顯著差異(P值分別為0.826、0.482)。 (六)遞質(zhì)與其代謝產(chǎn)物比值變化恐懼模型組與正常對(duì)照組在DA/DOPAC比值存在顯著差異(P=0.000)，恐懼模型組DA/DOPAC比值低于正常對(duì)照組；正常對(duì)照組與模型給藥組DA/DOPAC存在顯著性差異(P=0

13、.003)：5-HT/5-HIAA比值各組間比較未見顯著差異(均為P>0.05)。 (七)遞質(zhì)問平衡關(guān)系 5-HT/DA、NE/DA、5-HT/NE在各組比值無顯著性差異(均為P>0.05)。 結(jié)論： 一、依據(jù)經(jīng)典條件反射原理，采用Takashi方法建立恐懼應(yīng)激模型，在電擊與光照之間建立聯(lián)系，盡量降低軀體刺激的影響，同時(shí)在病因上力求符合中醫(yī)情志內(nèi)傷的原則，造模穩(wěn)定性高，方法簡(jiǎn)單，可行性好。 二、對(duì)恐懼應(yīng)激模型

14、進(jìn)行大鼠行為學(xué)檢測(cè)及應(yīng)激后曠場(chǎng)行為學(xué)檢測(cè)，量化評(píng)定，根據(jù)行為學(xué)得分及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)分析，恐懼可減弱大鼠興奮性及適應(yīng)能力，這種表現(xiàn)與人的情緒反應(yīng)有一定程度的相似性，說明此模型能夠有效模擬人類恐懼情緒，是較為理想的中醫(yī)情志內(nèi)傷模型。 三、恐懼應(yīng)激可激活HPA軸，從而升高ACTH、CORT水平，恐懼應(yīng)激模型組和正常對(duì)照組ACTH、CORT水平有顯著性差異。 四、恐懼應(yīng)激對(duì)血清IL-2未見顯著影響，各組大鼠IL-2未見顯著差異；

15、 恐懼應(yīng)激可導(dǎo)致血清IL-8水平升高，與正常對(duì)照組差異顯著。五、恐懼應(yīng)激可導(dǎo)致下丘腦NE、E、DA、5-HT含量降低，恐懼模型組與正常對(duì)照組NE、E含量有顯著性差異。 六、恐懼應(yīng)激可導(dǎo)致下丘腦MHPG、HVA含量降低，恐懼模型組與正常對(duì)照組MHPG、HVA存在顯著差異。 七、恐懼應(yīng)激可導(dǎo)致DA/DOPAC比值下降，恐懼模型組與正常對(duì)照組在DA/DOPAC比值存在顯著差異。 八、桑螵蛸散能升高下丘腦NE、E、5-

16、HT含量水平至正常水平，抑制HPA軸活性，桑螵蛸散給藥組與恐懼模型組NE、E、5-HT有顯著性差異，正常對(duì)照組與模型給藥組在NE、E、5-HT方面未見顯著差異。 綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本實(shí)驗(yàn)根據(jù)中醫(yī)七情理論，依據(jù)經(jīng)典條件反射原理建立恐懼應(yīng)激模型，以行為學(xué)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估，基本符合中醫(yī)情志內(nèi)傷的發(fā)病過程?？謶帜Ｐ徒MACTH、CORT水平含量顯著升高，表明恐懼應(yīng)激可升高HPA軸活性，提高應(yīng)激水平；恐懼模型組下丘腦NE、E、DA、5-HT含量