腦出血大鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植后IL-2、IL-10的表達(dá)及中藥干預(yù)的影響.pdf

1、研究背景腦出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)是急性腦血管病中的危重類型，腦出血后最初30天的死亡率是43-51％，存活者75％留有不同程度殘疾，致使病人生活質(zhì)量嚴(yán)重下降，同時也給社會、家庭帶來了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSC)的發(fā)現(xiàn)給腦血管疾病的治療帶來新的希望，但由于腦出血后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生的數(shù)目有限，不足以修復(fù)腦出血后神經(jīng)損傷，因此用外源性神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦出血

2、有可能取得滿意的效果。然而腦出血后血腦屏障破壞，大量血液細(xì)胞侵入腦內(nèi)，其中免疫細(xì)胞激活導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放。這種腦內(nèi)環(huán)境的改變既可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表面表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子，促進(jìn)抗原遞呈及識別，也可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞NIHC分子的表達(dá)，腦內(nèi)原有的“免疫豁免”環(huán)境發(fā)生了改變，可誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)，加重組織損傷。 根據(jù)免疫反應(yīng)理論，腦出血血腦屏障損傷情況下，用NSC移植治療可能發(fā)生移植物抗宿主反應(yīng)(GVHD))，即以Th1

3、為主，Th2、CTL參與的免疫反應(yīng)。Th1釋放許多細(xì)胞因子，如IL-2、IFN-γ等，引起腦組織引起炎癥反應(yīng)。IL-2無論在腦出血的炎癥反應(yīng)或免疫排斥過程中，均起著關(guān)鍵作用。Th2分泌的IL-10、IL-4與免疫移植中免疫耐受有密切關(guān)系。 目的：本研究旨在通過觀察瀉火補腎湯對白介素-2(interleukin 2，IL-2)和白介素-10(interleukin 10、IL-10)在NSC移植后腦出血大鼠腦內(nèi)表達(dá)的影響，探討瀉火

4、補腎湯在NSC移植免疫反應(yīng)中的作用及可能機制。 方法：1.分離培養(yǎng)初生3-5天SD大鼠海馬組織神經(jīng)干細(xì)胞，用nestin抗原免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，然后進(jìn)行傳代。2.用補體依賴性細(xì)胞毒實驗方法(CDC)檢測SD大鼠的群體反應(yīng)性抗體(Paner reactiveAntibody,PRA)值，選取致敏、高敏大鼠260只準(zhǔn)備進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植實驗；3.260只大鼠隨機分為A組(正常組，n=10)、B組(假手術(shù)組，n=10)、C組(腦出血組，

5、n=50)、D組(腦出血瀉火補腎湯組，n=50)、E組(腦出血NSC移植組，n=50)及F組(腦出血NSC移植加瀉火補腎湯組，n=50)，Ⅶ型膠原酶注入蒼白球復(fù)制腦出血模型，術(shù)后2d進(jìn)行NSC移植，第2d、4d、7d、14d、28d分5批處死，取腦組織標(biāo)本，分別用RT-PCR及免疫組化(SABC)方法檢測大鼠腦組織IL-2、IL-10mRNA和蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果: 1.免疫組化 (1)免疫組化檢測腦內(nèi)IL-2

6、蛋白表達(dá)：正常組腦組織見陽性細(xì)胞少量表達(dá)，各組術(shù)后2d可見陽性細(xì)胞明顯增多，4d達(dá)到高峰(P<0.05)，其中E組染色陽性細(xì)胞最多，7d、14d逐漸減少，28d B、C、D、F組基本回落至正常，但E組與正常組比較仍表達(dá)有增高(P<0.01)。各組各時間點中E組IL-2表達(dá)最強(P<0.05)。同時間點F組比E組、D組比C組IL-2表達(dá)減弱(P<0.05)，陽性細(xì)胞主要分布于血腫周邊組織，根據(jù)形態(tài)判斷主要為少突膠質(zhì)細(xì)胞。 (2)免

7、疫組化檢測腦內(nèi)IL-10蛋白表達(dá)：正常腦組織見少量陽性細(xì)胞散在分布，各組術(shù)后2d可見表達(dá)升高，14d時達(dá)峰值(P<0.05)，28d時陽性細(xì)胞明顯減少(P<0.05)。各組各時間點中F組IL-10表達(dá)最強(P<0.05)。同時間點除28d外，F(xiàn)組比E組、D組比C組IL-10表達(dá)增強(P<0.05)。染色陽性的細(xì)胞主要分布于血腫周邊組織，根據(jù)形態(tài)判定主要為纖維性星型膠質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞。 2.RT-PCR(1)RT-PCR檢測腦內(nèi)IL-2

8、 mRNA表達(dá)：正常組IL-2 mRNA僅有極少量表達(dá)，2d時B、C、D、E、F五組IL-2 mRNA表達(dá)較A組顯著升高(P<0.01)，且4d時達(dá)到表達(dá)高峰(P<0.05)，其中E組表達(dá)最強(P<0.05)。7d、14d時IL-2 mRNA表達(dá)逐漸下降(P<0.05)，28d時B、C、D、F 4組基本減少至正常，但E組與正常組比較表達(dá)仍有增高(P<0.05)。同時間點，F(xiàn)組比E組、D組比C組IL-2 mRNA表達(dá)明顯減弱(P<0.05

9、)。 (2)RT-PCR檢測腦內(nèi)IL-10 mRNA表達(dá)：正常組IL-10 mRNA有少量表達(dá)。2d后B、C、D、E、F五組IL-10 mRNA表達(dá)較A組升高，其中F組(腦出血神經(jīng)干細(xì)胞移植加瀉火補腎湯組)表達(dá)最強(P<0.01)，7d逐漸增強(P<0.05)，14d時可見B、C、D、E四組IL-10mRNA表達(dá)高峰(P<0.05)，28d B、C、D、E、F五組較14d表達(dá)下調(diào)。同時間點，F(xiàn)組比E組、D組比C組IL-10 mR