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文檔簡介
1、研究背景腦出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是急性腦血管病中的危重類型,腦出血后最初30天的死亡率是43-51%,存活者75%留有不同程度殘疾,致使病人生活質(zhì)量嚴(yán)重下降,同時(shí)也給社會(huì)、家庭帶來了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSC)的發(fā)現(xiàn)給腦血管疾病的治療帶來新的希望,但由于腦出血后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生的數(shù)目有限,不足以修復(fù)腦出血后神經(jīng)損傷,因此用外源性神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦出血
2、有可能取得滿意的效果。然而腦出血后血腦屏障破壞,大量血液細(xì)胞侵入腦內(nèi),其中免疫細(xì)胞激活導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放。這種腦內(nèi)環(huán)境的改變既可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表面表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子,促進(jìn)抗原遞呈及識(shí)別,也可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞NIHC分子的表達(dá),腦內(nèi)原有的“免疫豁免”環(huán)境發(fā)生了改變,可誘發(fā)免疫排斥反應(yīng),加重組織損傷。 根據(jù)免疫反應(yīng)理論,腦出血血腦屏障損傷情況下,用NSC移植治療可能發(fā)生移植物抗宿主反應(yīng)(GVHD)),即以Th1
3、為主,Th2、CTL參與的免疫反應(yīng)。Th1釋放許多細(xì)胞因子,如IL-2、IFN-γ等,引起腦組織引起炎癥反應(yīng)。IL-2無論在腦出血的炎癥反應(yīng)或免疫排斥過程中,均起著關(guān)鍵作用。Th2分泌的IL-10、IL-4與免疫移植中免疫耐受有密切關(guān)系。 目的:本研究旨在通過觀察瀉火補(bǔ)腎湯對(duì)白介素-2(interleukin 2,IL-2)和白介素-10(interleukin 10、IL-10)在NSC移植后腦出血大鼠腦內(nèi)表達(dá)的影響,探討瀉火
4、補(bǔ)腎湯在NSC移植免疫反應(yīng)中的作用及可能機(jī)制。 方法:1.分離培養(yǎng)初生3-5天SD大鼠海馬組織神經(jīng)干細(xì)胞,用nestin抗原免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定,然后進(jìn)行傳代。2.用補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)方法(CDC)檢測(cè)SD大鼠的群體反應(yīng)性抗體(Paner reactiveAntibody,PRA)值,選取致敏、高敏大鼠260只準(zhǔn)備進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn);3.260只大鼠隨機(jī)分為A組(正常組,n=10)、B組(假手術(shù)組,n=10)、C組(腦出血組,
5、n=50)、D組(腦出血瀉火補(bǔ)腎湯組,n=50)、E組(腦出血NSC移植組,n=50)及F組(腦出血NSC移植加瀉火補(bǔ)腎湯組,n=50),Ⅶ型膠原酶注入蒼白球復(fù)制腦出血模型,術(shù)后2d進(jìn)行NSC移植,第2d、4d、7d、14d、28d分5批處死,取腦組織標(biāo)本,分別用RT-PCR及免疫組化(SABC)方法檢測(cè)大鼠腦組織IL-2、IL-10mRNA和蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果: 1.免疫組化 (1)免疫組化檢測(cè)腦內(nèi)IL-2
6、蛋白表達(dá):正常組腦組織見陽性細(xì)胞少量表達(dá),各組術(shù)后2d可見陽性細(xì)胞明顯增多,4d達(dá)到高峰(P<0.05),其中E組染色陽性細(xì)胞最多,7d、14d逐漸減少,28d B、C、D、F組基本回落至正常,但E組與正常組比較仍表達(dá)有增高(P<0.01)。各組各時(shí)間點(diǎn)中E組IL-2表達(dá)最強(qiáng)(P<0.05)。同時(shí)間點(diǎn)F組比E組、D組比C組IL-2表達(dá)減弱(P<0.05),陽性細(xì)胞主要分布于血腫周邊組織,根據(jù)形態(tài)判斷主要為少突膠質(zhì)細(xì)胞。 (2)免
7、疫組化檢測(cè)腦內(nèi)IL-10蛋白表達(dá):正常腦組織見少量陽性細(xì)胞散在分布,各組術(shù)后2d可見表達(dá)升高,14d時(shí)達(dá)峰值(P<0.05),28d時(shí)陽性細(xì)胞明顯減少(P<0.05)。各組各時(shí)間點(diǎn)中F組IL-10表達(dá)最強(qiáng)(P<0.05)。同時(shí)間點(diǎn)除28d外,F(xiàn)組比E組、D組比C組IL-10表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)。染色陽性的細(xì)胞主要分布于血腫周邊組織,根據(jù)形態(tài)判定主要為纖維性星型膠質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞。 2.RT-PCR(1)RT-PCR檢測(cè)腦內(nèi)IL-2
8、 mRNA表達(dá):正常組IL-2 mRNA僅有極少量表達(dá),2d時(shí)B、C、D、E、F五組IL-2 mRNA表達(dá)較A組顯著升高(P<0.01),且4d時(shí)達(dá)到表達(dá)高峰(P<0.05),其中E組表達(dá)最強(qiáng)(P<0.05)。7d、14d時(shí)IL-2 mRNA表達(dá)逐漸下降(P<0.05),28d時(shí)B、C、D、F 4組基本減少至正常,但E組與正常組比較表達(dá)仍有增高(P<0.05)。同時(shí)間點(diǎn),F(xiàn)組比E組、D組比C組IL-2 mRNA表達(dá)明顯減弱(P<0.05
9、)。 (2)RT-PCR檢測(cè)腦內(nèi)IL-10 mRNA表達(dá):正常組IL-10 mRNA有少量表達(dá)。2d后B、C、D、E、F五組IL-10 mRNA表達(dá)較A組升高,其中F組(腦出血神經(jīng)干細(xì)胞移植加瀉火補(bǔ)腎湯組)表達(dá)最強(qiáng)(P<0.01),7d逐漸增強(qiáng)(P<0.05),14d時(shí)可見B、C、D、E四組IL-10mRNA表達(dá)高峰(P<0.05),28d B、C、D、E、F五組較14d表達(dá)下調(diào)。同時(shí)間點(diǎn),F(xiàn)組比E組、D組比C組IL-10 mR
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