第一部分 半胱氨酰白三烯受體1拮抗劑篩選方法的建立;第二部分 二氫青蒿素抑制大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡.pdf

1、目的：星形細(xì)胞瘤是腦內(nèi)常見(jiàn)的腫瘤,目前沒(méi)有十分有效的療法.惡性膠質(zhì)瘤常用外科手術(shù)、放療和化療,但預(yù)后較差.青蒿素及其衍生物是安全有效的抗瘧疾藥物,近來(lái)發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗腫瘤作用.能夠選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞,而對(duì)正常細(xì)胞毒性很小.二氫青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)是青蒿素在體內(nèi)的主要活性代謝產(chǎn)物,其抗腫瘤活性大于青蒿琥酯和青蒿素.并且,DHA能夠穿過(guò)血腦屏障,因而,可能對(duì)腦內(nèi)腫瘤的治療有一定作用.我們的實(shí)驗(yàn)是研究DHA

2、對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞(C6細(xì)胞)增殖和凋亡的影響. 方法：在培養(yǎng)的C6細(xì)胞,加入DHA 1～125μmol/L作用24、48、72h.以臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)和噻唑藍(lán)(MTT)還原反應(yīng),觀察細(xì)胞增殖和活性;以Hoechst 33342染色,觀察細(xì)胞凋亡;以H<,2>DCFDA氧化試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(reactive oxygenspecies,ROS)變化. 結(jié)果：(1)DHA 5-125μmol/L濃度及時(shí)間依賴性抑制C6

3、細(xì)胞的增殖,作用48h后的IC<,50>是23.4μmol/L.(2)5μmol/L DHA作用24h時(shí)后即可誘導(dǎo)凋亡(P<0.05),48 h后凋亡率可達(dá)到30﹪以上(P<0.01);25μmol/L凋亡率接近50﹪.(3)5～125μmol/L增高細(xì)胞內(nèi)的ROS(P<0.01),5μmol/L可增加ROS達(dá)1倍;25μmol/L可增加2倍左右;125μmol/L增加4倍以上. 結(jié)論： 1.DHA能夠抑制C6細(xì)胞增殖,

4、誘導(dǎo)其凋亡,其細(xì)胞毒作用與細(xì)胞內(nèi)ROS增加相關(guān). 2.DHA能夠殺傷腫瘤細(xì)胞,并能穿過(guò)血腦屏障,可能成為治療腦內(nèi)膠質(zhì)瘤的有效成分. 目的：半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes,CysLTS)是花生四烯酸經(jīng)5-脂氧合酶(5-lipoxygenase,5-LOX)途徑代謝產(chǎn)生的重要炎癥介質(zhì),參與外周炎性疾病以及腦卒中、腦外傷、腦腫瘤等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過(guò)程.CvsLTs的作用由cysLT<,1

5、>和CysLT<,2>受體介導(dǎo).已經(jīng)初步證明,CysLTs啟動(dòng)受體后,通過(guò)激發(fā)細(xì)胞內(nèi)貯存Ca<'2+>釋放而發(fā)揮效應(yīng).我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CysLT<,1>受體參與大鼠和小鼠的腦缺血損傷.CysLT<,1>受體有選擇性拮抗劑,但存在非受體效應(yīng),還需要繼續(xù)尋找新的化合物;而對(duì)于CysLT<,2>受體尚無(wú)選擇性拮抗劑,因此,對(duì)其功能了解較少.本研究目的為了建立細(xì)胞模型及篩選方法,初篩CysLT<,1>受體拮抗劑,為進(jìn)一步尋找新的化合物及研制新藥提供

6、基礎(chǔ). 方法：選用分化后高表達(dá)CysLT<,1>受體的人白血病細(xì)胞株dU937細(xì)胞,激動(dòng)劑LTD<,4>攻擊后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度變化,作為CysLT<,1>受體拮抗劑的篩選方法,初步篩選有拮抗劑活性的化合物,以cysLT<,1>受體拮抗劑pranlukast和montelukast作為參照;并進(jìn)一步在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧缺糖損傷(OGD)模型上觀察初篩化合物抗損傷作用. 結(jié)果：dU937細(xì)胞高表達(dá)CysLT<,

7、1>受體蛋白.陽(yáng)性刺激物ATP 5×10<'-5> M能顯著升高du937細(xì)胞內(nèi)鈣(30﹪);LTD<,4> 10<'-7>M的作用約為ATP的56﹪.cysLT<,1>受體拮抗劑pranlukast和montelukast能抑制LTD<,4>誘導(dǎo)的du937細(xì)胞內(nèi)鈣升高,IC<,50>分別為9.2×10<'-8>.M和7.5×10<'-8>M.新合成的化合物Dxw.1、10、11、12、13、19也能部分抑制LTD<,4>誘導(dǎo)的鈣信號(hào)

8、,IC<,50>在2.2×10<'-8>.M至2.4×10<'-7>M之間,最大抑制率19﹪～23﹪.D<,xw>-10、11、12在10<'-6>M對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞沒(méi)有毒性作用,但也不能抑制OGD引起的損傷;而同濃度pranlukast有保護(hù)作用. 結(jié)論： 1.dLl937細(xì)胞可以作為CysLT<,1>受體細(xì)胞模型;在此細(xì)胞上確定了Ca<'2+>測(cè)定條件,建立了初步篩選CysLT<,1>受體拮抗劑的方法. 2