第一部分：半胱氨酰白三烯受體對缺氧缺糖損傷中大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞水通道蛋白4表達(dá)的調(diào)節(jié)第二部分：新型半胱氨酰白三烯受體GPR17的多克隆抗體制備及其鑒定.pdf

1、目的：⑴探討CysLT受體對缺氧缺糖損傷/恢復(fù)(OGDIR)后，星形膠質(zhì)細(xì)胞水通道蛋白4( AQP4)表達(dá)及細(xì)胞損傷的調(diào)節(jié)作用，以及可能的信號通路。⑵制備新型半胱氨酰白三烯受體GPR17的多克隆抗體(pAb)，并鑒定其免疫學(xué)特性。
　　 方法：①以MTT及LDH法，檢測不同時間OGD后恢復(fù)24 h對原代培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響，確定合適的時間點制作OGD/恢復(fù)(OGD/R)誘導(dǎo)損傷的模型；②以RT-PCR及免疫組化法，檢測

2、該條件下大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞CysLT1及CysLT2受體的表達(dá)情況；③以MTT及LDH法，檢測CysLT受體拮抗劑對OGD/R引起原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的作用，并以Western blot及免疫組化法，檢測對AQP4表達(dá)的影響；④以AQP4 siRNA抑制AQP4表達(dá)，進(jìn)一步確定AQP4在OGD/R損傷中的作用；⑤最后，以Westem blot法檢測MAPK通路的激活，并觀察MAPK抑制劑對OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷及其對AQP

3、4表達(dá)的影響。⑥以KLH偶聯(lián)的GPR17多肽免疫家兔制備其pAb，用間接ELISA法測定抗體效價，阻斷ELISA測定抗體敏感性及特異性，同時以新制備的抗體做Westem blot，檢測GPR17的組織表達(dá)。
　　 結(jié)果：⑴原代培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞隨OGD時間的延長，損傷逐步加重，在OGD4h/恢復(fù)24 h(OGD4 h/R24 h)時細(xì)胞存活率在65％～70％左右，將此條件作為后續(xù)實驗的損傷條件。正常培養(yǎng)條件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞有C

4、ysLT1受體的表達(dá)，而CysLT2受體表達(dá)很弱，OGD4 h/R24 h后，CysLT1受體的表達(dá)基本不變，而CysLT2受體表達(dá)明顯增強(qiáng)。OGD4 h/R24 h誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，可被CysLT2受體選擇性拮抗劑BaycysLT2(1μM)及受體非選擇性拮抗劑Bayu9773(1μM)所拮抗，而不被CysLT1受體選擇性拮抗劑孟魯司特(1μM)所拮抗，證明CysLT2受體介導(dǎo)OGD4 h/R24 h誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷。同

5、時OGD4 h/R24 h后AQP4的表達(dá)上調(diào)，并且這種作用同樣可被CysLT2受體拮抗劑而非CysLT1受體拮抗劑所抑制。AQP4 siRNA抑制AQP4表達(dá)，并減輕OGD4 h/R24 h誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，進(jìn)一步證明OGD過程中AQP4的表達(dá)增加，加重細(xì)胞損傷。同時，OGD4 h/R24 h損傷后ERKI/2、p38被激活，并且ERK1/2、p38的抑制劑能夠拮抗OGD4 h/R24 h誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷及AQP4上調(diào)。⑵通過免疫家兔獲得

6、的抗GPR17 pAb，ELISA測定顯示其抗體效價最高可達(dá)到1/16364，并對CysLT1受體和CysLT2受體基本無交叉反應(yīng)，具有較好的特異性。Westem blot結(jié)果顯示，GPR17在大鼠腦和心臟組織中有較高的表達(dá)，其分子量在43 kD左右。
　　 結(jié)論：①CysLT2受體介導(dǎo)OGD4h/R24 h誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷。②OGD4 h/R24 h后，CysLT2受體介導(dǎo)AQP4表達(dá)上調(diào)，這種上調(diào)加重OGD4 h/R2