MicroRNA-34c對血腫瘤屏障通透性和膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及作用機(jī)制研究.pdf

1、MicroRNA(miRNAs)是一類長度約22～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼微小RNA。miRNAs能特異性地識(shí)別其下游靶基因信使RNA(mRNA)的3'非翻譯區(qū)(3'untranslated regions，3'UTR)，并與之互補(bǔ)結(jié)合，使mRNA降解或抑制mRNA的翻譯，多在基因的轉(zhuǎn)錄后水平上起調(diào)控作用，在細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。
　　MicroRNA-34(miR-34)是一類進(jìn)化高度保守的miR

2、NA家族，通過參與多種細(xì)胞的增殖，存活，凋亡，遷移，侵襲和血管生成等，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。在脊椎動(dòng)物基因組內(nèi)，miR-34家族有三個(gè)成員:miR-34a，miR-34b和miR-34c。據(jù)報(bào)道，miR-34a在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中低表達(dá)，是潛在的抑癌基因。上調(diào)miR-34a的表達(dá)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯或凋亡，發(fā)揮抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用。最近的報(bào)道指出，miR-34c在膠質(zhì)瘤患者的腦組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-34c能

3、顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和U87的增殖，因此，我們推測miR-34c可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了與miR-34a相似的作用。但是miR-34c在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)水平及其發(fā)揮的作用目前尚不清楚。此外，有報(bào)道稱miR-34a通過抑制沉默信息調(diào)節(jié)子1(silent information regulator1，SIRT1)誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老，并阻礙其血管生成;過表達(dá)miR-34a誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老并抑制其細(xì)胞增殖

4、。這些研究表明miR-34a可能參與內(nèi)皮細(xì)胞的功能調(diào)控。據(jù)檢索，關(guān)于miR-34c是否參與血腫瘤屏障(blood-tumor barrier，BTB)的通透性以及膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞(glioma microvascular endothelial cells，GECs)的生物學(xué)行為的調(diào)控，目前尚未見報(bào)道。
　　Myc的相關(guān)鋅指蛋白(myc-associatedzinc-finger protein，MAZ)是一個(gè)含有豐富脯氨酸、

5、丙氨酸重復(fù)和6個(gè)C2H2型鋅指模序，以及5個(gè)能被酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄因子，其基因是位于人染色體16p11.2的單拷貝基因，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為2.7 kb的mRNA，編碼分子量為60 kD的MAZ蛋白。已有的研究結(jié)果表明，MAZ在啟動(dòng)和終止靶基因轉(zhuǎn)錄的過程中發(fā)揮著雙重作用。MAZ基因的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。Smits等報(bào)道MAZ在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的腦血管中表達(dá)升高，miR-125b誘導(dǎo)的MAZ下調(diào)能在體外抑制人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞

6、遷移和血管生成，這表明MAZ能夠參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能。但是，MAZ是否參與miR-34c對膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)還未見報(bào)道。
　　在本研究中，我們應(yīng)用miR-34c過表達(dá)和表達(dá)沉默質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的hCMEC/D3細(xì)胞，成功建立體外BTB模型;研究miR-34c表達(dá)變化對BTB通透性的影響以及對膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響，并初步明確其可能的分子機(jī)制，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新途徑。
　　方法:

7、r>　　1、人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系hCMEC/D3細(xì)胞，人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87細(xì)胞和人胚腎細(xì)胞系HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)。
　　2、miR-34c和MAZ過表達(dá)或表達(dá)沉默穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立。
　　3、體外BTB模型的建立。
　　4、應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-34c在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)源性表達(dá)水平。
　　5、應(yīng)用跨內(nèi)皮電阻(transendothelial electric resistance，

8、TEER)和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)滲出量評估體外BTB模型的通透性變化。
　　6、應(yīng)用RT-PCR、Westeern blot和免疫熒光法檢測膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中MAZ、緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和occludin的mRNA以及蛋白表達(dá)水平變化。
　　7、應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因分析miR-34c和MAZ的直接作用。
　　8、應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀分析MAZ與緊密連接相關(guān)蛋白

9、ZO-1和occludin的直接作用。
　　9、應(yīng)用MTS法檢測膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力變化。
　　10、應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡變化。
　　11、應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力變化。
　　12、應(yīng)用小管形成實(shí)驗(yàn)檢測膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力變化。
　　結(jié)果:
　　1、成功建立miR-34c和MAZ過表達(dá)或表達(dá)沉默的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

10、細(xì)胞系。
　　2、成功建立體外BTB模型，獲得膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　3、miR-34c在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)較正常腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)顯著升高。
　　4、miR-34c過表達(dá)顯著增加BTB的通透性，miR-34c表達(dá)沉默顯著降低BTB的通透性。
　　5、miR-34c過表達(dá)顯著下調(diào)緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和occludin的分布和表達(dá);miR-34c表達(dá)沉默

11、顯著上調(diào)ZO-1和occludin的分布和表達(dá)。
　　6、MAZ是miR-34c的靶基因。
　　7、miR-34c過表達(dá)顯著下調(diào)MAZ的分布和表達(dá);miR-34c表達(dá)沉默顯著上調(diào)MAZ的分布和表達(dá)。
　　8、miR-34c和MAZ反向共同調(diào)節(jié)BTB的通透性。
　　9、miR-34c和MAZ反向共同調(diào)節(jié)緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和occludin的表達(dá)水平。
　　10、膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中MAZ與緊密連接相關(guān)

12、蛋白ZO-1和occludin的啟動(dòng)子直接結(jié)合。
　　11、miR-34c過表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖;miR-34c表達(dá)沉默促進(jìn)其增殖。
　　12、miR-34c過表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡;miR-34c表達(dá)沉默抑制其凋亡。
　　13、miR-34c過表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移;miR-34c表達(dá)沉默促進(jìn)其遷移
　　14、miR-34c過表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成;miR-

13、34c表達(dá)沉默促進(jìn)其血管生成。
　　討論:
　　我們的研究證明，在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-34c的表達(dá)水平顯著高于在正常腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。許多研究表明miR-34c參與多種人類惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。大多數(shù)報(bào)道表明，miR-34c在前列腺癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等癌癥中表達(dá)下調(diào)，因此miR-34c被認(rèn)為是候選的抑癌基因。然而，Yamazaki等發(fā)現(xiàn)miR-34c在多種人黑色素瘤細(xì)胞系中差異表達(dá):在A375細(xì)胞系中低

14、表達(dá)，而在G361和SK-MEL-24細(xì)胞系中高表達(dá)。此外，與正常組織相比，miR-34c在未分化型胃癌組織中顯著上調(diào)。miR-34c在不同腫瘤細(xì)胞以及不同組織中呈現(xiàn)不同的表達(dá)水平，在不同的微環(huán)境下，miR-34c在不同的腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能起不同的作用。然而，miR-34c是否參與調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能并進(jìn)一步調(diào)節(jié)BTB通透性仍不清楚。
　　為探討miR-34c對BTB功能的影響，我們建立了miR-34過表達(dá)或表達(dá)沉默的穩(wěn)定

15、轉(zhuǎn)染細(xì)胞，成功建立了體外BTB模型。分別應(yīng)用TEER和HRP滲出量檢測BTB的通透性。結(jié)果顯示，miR-34c過表達(dá)導(dǎo)致BTB的通透性增加;而miR-34c表達(dá)沉默對BTB起相反的調(diào)節(jié)作用。緊密連接在血腦屏障的形成和維持中發(fā)揮重要作用。ZO-1定位于胞漿膜表面，occludin是整合膜蛋白，二者都是緊密連接的重要組成部分。在本研究中，RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示miR-34c過表達(dá)顯著下調(diào)ZO-1和occludin

16、的mRNA和蛋白表達(dá);相反，miR-34c的表達(dá)沉默誘導(dǎo)ZO-1和occludin表達(dá)上調(diào)。免疫熒光染色的結(jié)果與RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果相一致。目前，我們已經(jīng)證明了miR-34c通過調(diào)節(jié)ZO-1和occludin的表達(dá)改變BTB的通透性。
　　然而，miR-34c調(diào)節(jié)BTB通透性的可能機(jī)制仍不清楚。據(jù)我們所知，miR-34c通過降解mRNA和抑制翻譯介導(dǎo)基因沉默。一些癌基因或調(diào)節(jié)因子，例如c-myc、bcl-

17、2和SIRT1，被認(rèn)為是miR-34c的靶基因。作為一種轉(zhuǎn)錄因子，MAZ被認(rèn)為是一些miRNA的可能的下游靶點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，miR-125b的過表達(dá)可誘導(dǎo)MAZ表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而抑制VEGF介導(dǎo)的血管生成。我們應(yīng)用生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測到在MAZ mRNA的3'UTR有一個(gè)潛在的miR-34c結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示MAZ是miR-34c的靶基因。此外，miR-34c過表達(dá)能夠下調(diào)MAZ的mRNA和蛋白表達(dá)，而m

18、iR-34c沉默則上調(diào)其表達(dá)。其他研究者的研究結(jié)果也支持我們的觀點(diǎn)。比如，在前列腺癌和乳腺癌中miR-34c的表達(dá)下調(diào)，而MAZ的表達(dá)上調(diào)。為了更好地研究miR-34c與MAZ的作用關(guān)系，我們在hCMEC/D3細(xì)胞中同時(shí)過表達(dá)或表達(dá)沉默miR-34c或MAZ，然后建立體外BTB模型。結(jié)果顯示，miR-34c和MAZ反向共同調(diào)節(jié)BTB的通透性和緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和occludin的表達(dá)。這進(jìn)一步說明了miR-34c通過靶定MAZ，介

19、導(dǎo)緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和occludin的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)BTB的通透性。我們進(jìn)一步的染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果表明，在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，MAZ可以與ZO-1啟動(dòng)子區(qū)第二個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)(GGGCGGG)以及occludin啟動(dòng)子區(qū)第一個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)(CCCTCCC)相結(jié)合。轉(zhuǎn)錄因子不僅可以通過控制轉(zhuǎn)錄速率來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA和蛋白質(zhì))的數(shù)量，而且可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子本身。最近的一項(xiàng)研究顯示，MAZ與胎兒Alz-50克隆1(feta

20、l Alz-50 clone1，F(xiàn)AC1)相互作用改變了MAZ的轉(zhuǎn)錄能力。MAZ蛋白能抑制MAZ基因的表達(dá)，被MAZ抑制的eNOS基因的表達(dá)參與調(diào)節(jié)MAZ基因的自我抑制。然而，MAZ與緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和occludin的直接結(jié)合能否調(diào)節(jié)MAZ的轉(zhuǎn)錄活性還需進(jìn)一步探索。
　　膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性生長是多因素參與、多步驟完成的復(fù)雜過程，主要依賴于腫瘤血管的發(fā)生與生長。膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞在這一過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。我們進(jìn)一步

21、研究了miR-34c對膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，結(jié)果表明，miR-34c抑制膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，抑制膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和血管生成。腫瘤血管是腫瘤形成、生長及轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，因此”以腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶點(diǎn)的抗腫瘤血管治療是腫瘤治療的重要策略之一。
　　本研究證明了miR-34c可能是BTB通透性和膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為的重要調(diào)節(jié)子。miR-34c通過靶定MAZ，介導(dǎo)緊密

22、連接相關(guān)蛋白ZO-1和occludin的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)BTB的通透性;miR-34c促進(jìn)膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，抑制膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成。由此我們認(rèn)為miR-34c可能是膠質(zhì)瘤治療的潛在靶點(diǎn)，為膠質(zhì)瘤等中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的治療提供新的策略。
　　結(jié)論:
　　1、miR-34c在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)較正常腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯升高。
　　2、MAZ是miR-34c的靶基因，miR-34c在轉(zhuǎn)