MicroRNa-34c在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響和機(jī)制研究.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤是始發(fā)于顱內(nèi)的最常見惡性腫瘤，占所有惡性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的78％，占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的40％。當(dāng)今世界膠質(zhì)瘤的治療仍然是神經(jīng)外科領(lǐng)域最棘手的問題之一，目前，針對(duì)膠質(zhì)瘤尚無有效的篩查或早期診斷方法，確診時(shí)往往已為晚期，盡管近幾十年來以手術(shù)為主的治療手段有很大的進(jìn)展，但是膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)速度快、邊界不清、術(shù)后容易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)都使膠質(zhì)瘤的治療效果難以令人滿意，其預(yù)后尚不樂觀，其中多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的中位生存期僅為12-15個(gè)月，因此在手術(shù)切除

2、腫瘤的同時(shí)必須尋找新的治療方法輔助治療才能使膠質(zhì)瘤的治療產(chǎn)生本質(zhì)的進(jìn)步。近年來，有關(guān)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷和治療的研究已深入到了分子水平，涉及到膠質(zhì)瘤發(fā)生，發(fā)展，尤其是演變過程的基因有多種。因此尋找與膠質(zhì)瘤發(fā)生相關(guān)的致病基因，從基因水平上進(jìn)行針對(duì)性防治可能成為有效治療膠質(zhì)瘤的根本途徑。
　　 miRNAs是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNAs，通過與靶mRNA3'非編碼區(qū)完全或非完全互補(bǔ)的結(jié)合而導(dǎo)致靶mRNA的降解或翻譯過

3、程的抑制，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)，miRNAs能參與一系列重要的生物學(xué)行為，例如細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖與凋亡、應(yīng)激反應(yīng)等，同時(shí)有報(bào)道m(xù)iRNAs與人類癌癥的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，在腫瘤的發(fā)生過程中起到調(diào)控的樞紐作用，因此已經(jīng)有專家預(yù)測(cè)，把miRNA作為腫瘤生物治療的靶分子將比編碼分子作為靶分子更加有效。miRNA將成為腫瘤生物治療領(lǐng)域的一個(gè)新亮點(diǎn)，可能會(huì)給腫瘤的藥物設(shè)計(jì)和進(jìn)行針對(duì)性治療提供一個(gè)新的平臺(tái)。
　　 已有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-34參

4、與p53和Notch信號(hào)通路的調(diào)控，具有腫瘤抑制的特性。在哺乳動(dòng)物中，miR-34家族包括3類:miR-34a具有自己的轉(zhuǎn)錄本，而miR-34b和miR-34c則共享一個(gè)轉(zhuǎn)錄本。有報(bào)道稱在胰腺癌、骨肉瘤、乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌中miR-34a低表達(dá)或檢測(cè)不到。亦有報(bào)道m(xù)iR-34a在肺癌、乳腺癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌和黑色素瘤的細(xì)胞系中處于失活狀態(tài)。有人報(bào)道在惡性黑色素瘤、結(jié)腸直腸癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌中，由于CGP島甲基化表現(xiàn)為miR-34

5、b/c的失活。并且，miR-34a的低表達(dá)和非小細(xì)胞肺癌的高復(fù)發(fā)率相關(guān)，表明miR-34a能夠作為對(duì)非小細(xì)胞肺癌判斷預(yù)后的新的靶標(biāo)。到目前為止，所有已發(fā)表的數(shù)據(jù)表明在惡性腫瘤中miR-34的失活是常有的事。但miR-34c作為miR-34家族中的一員，在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展起到的具體作用還未見報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用定量PCR方法對(duì)18例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本和5例腦組織標(biāo)本分別進(jìn)行miR-34c-3p和miR-34c-5p含

6、量的檢測(cè)，研究miR-34c-3p和miR-34c-5p在人類腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義。并應(yīng)用LipofectamineTM RNAiMAX對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251和U87進(jìn)行轉(zhuǎn)染，采用多種方法對(duì)轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)特性進(jìn)行檢測(cè)，而后應(yīng)用數(shù)據(jù)庫檢索miR-34c-3p和miR-34c-5p可能的下游靶基因，找到感興趣的共同調(diào)控的靶基因Notch2，并采用westen

7、blot實(shí)驗(yàn)方法及熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)進(jìn)行直接驗(yàn)證，探索miRNA-34c是否對(duì)靶基因Notch2有直接調(diào)控關(guān)系，進(jìn)一步闡明作用機(jī)理，期望為膠質(zhì)瘤的基因治療找到有效可行的治療靶點(diǎn)并為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，為腫瘤的治療提供一個(gè)新思路。本實(shí)驗(yàn)共分三個(gè)部分。
　　 第一部分miRNA-34c在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)研究
　　 目的:探討miRNA-34c在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況。
　　 方法:應(yīng)用定量PCR方法對(duì)18例

8、WHO分級(jí)Ⅱ-Ⅳ級(jí)的福爾馬林固定石蠟包埋的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本和外傷或腦出血患者內(nèi)減壓手術(shù)獲得的5例腦組織標(biāo)本分別進(jìn)行miR-34c-3p和miR-34c-5p含量的檢測(cè)，比較不同級(jí)別膠質(zhì)瘤和正常腦組織中miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達(dá)差異，分析miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達(dá)和膠質(zhì)瘤惡性程度的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:與正常腦組織相比，膠質(zhì)瘤中miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達(dá)皆顯著減少，而且

9、miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達(dá)隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別或惡性程度的增加分別減少，呈顯著的負(fù)相關(guān)（miR-34c-3p的spearman相關(guān)系數(shù)=-0.856，P＜0.001; miR-34c-5p的spearman相關(guān)系數(shù)=-0.767，P＜0.01)。
　　 結(jié)論:MiR-34c在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低，而且表達(dá)隨著腫瘤分級(jí)或惡性程度的增高而減少，與膠質(zhì)瘤級(jí)別的升高呈顯著的負(fù)相關(guān)。MiR-34c在膠質(zhì)瘤的進(jìn)展中

10、有重要的意義，可作為腦膠質(zhì)瘤臨床分級(jí)的重要指標(biāo)。
　　 第二部分上調(diào)miR-34c抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及侵襲
　　 目的:研究miR-34c對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251和U87的增殖、遷移、侵襲、凋亡和細(xì)胞周期的影響。
　　 方法:應(yīng)用脂質(zhì)體將miR-34c導(dǎo)入膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251和U87后，應(yīng)用定量PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，應(yīng)用MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化、Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲能力變化、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞

11、凋亡和細(xì)胞周期的改變。
　　 結(jié)果:在U87和U251細(xì)胞系中，miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達(dá)量要明顯小于正常膠質(zhì)細(xì)胞系HEB。而轉(zhuǎn)染了miR-34c-3p的U87和U251細(xì)胞，其miR-34c-3p的表達(dá)量明顯高于未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞(Normal組，P＜0.05)和NC組細(xì)胞(P＜0.05)，miR-34c-5p也呈同樣的變化。在U251細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-34c-3p或miR-34c-5p后48、72、96小

12、時(shí)，細(xì)胞存活率顯著低于Normal組(P＜0.05)和NC組(P＜0.05)。而在U87細(xì)胞中情況有所不同，轉(zhuǎn)染miR-34c-3p后48、72、96小時(shí)，細(xì)胞存活率顯著低于Normal組(P＜0.05)和NC組(P＜0.05);轉(zhuǎn)染miR-34c-5p后24、48、72、96小時(shí)，細(xì)胞存活率顯著低于Normal組(P＜0.05)，而與NC組沒有顯著差異(P＞0.05)。利用Transwell小室，U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-34c-3p或

13、miR-34c-5p后，其遷移至下室的細(xì)胞數(shù)量與Normal組和NC組相比顯著減少，在U87細(xì)胞中的情況相同。U251細(xì)胞高表達(dá)miR-34c-3p或miR-34c-5p，U87細(xì)胞高表達(dá)miR-34c-3p可以導(dǎo)致細(xì)胞停滯在S期，同時(shí)降低了G0/G1期的細(xì)胞數(shù)。在U251細(xì)胞中，凋亡細(xì)胞在Normal組和NC組分別占6.57％和6.3％，而轉(zhuǎn)染miR-34c-3p或miR-34c-5p后凋亡細(xì)胞所占比例上升分別占28.49％和28.1

14、4％。但是在U87細(xì)胞中有所不同，僅轉(zhuǎn)染miR-34c-3p后凋亡細(xì)胞數(shù)上升(3.56％)，而Normal組，NC組和轉(zhuǎn)染miR-34c-5p組分別為1.53％，1.68％和1.91％。
　　 結(jié)論:轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-34c在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)能夠抑制其增殖、遷移和侵襲能力，導(dǎo)致細(xì)胞周期在S期及G2/M期的停滯，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，為腦膠質(zhì)瘤靶向治療提供可靠的依據(jù)。但miR-34c-3p與miR34c-5p在不同細(xì)胞系中，影響細(xì)胞增

15、殖能力、細(xì)胞周期變化及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果有所不同，推測(cè)他們可能是通過不同靶點(diǎn)或機(jī)制起作用。
　　 第三部分MiR-34c在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的靶基因及作用機(jī)制
　　 目的:探討miR-34c在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中作用的下游靶基因及作用機(jī)制
　　 方法:通過miRanda、PICTAR、TargetScan三個(gè)數(shù)據(jù)庫篩選miR-34c的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，從中找到我們感興趣的基因，再利用定量PCR和Western技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞

16、該基因的表達(dá)情況，最后利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證該感興趣基因確實(shí)為miR-34c的下游靶基因。
　　 結(jié)果:通過多種數(shù)據(jù)庫的篩選，我們最終將感興趣的基因鎖定在Notch2。定量PCR的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-34c-3p后的Notch2 mRNA的表達(dá)量相比Normal組和NC組顯著降低(P＜0.05)，但轉(zhuǎn)染miR-34c-5p后卻沒有明顯變化。Western blot的結(jié)果同樣顯示，U251和U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-34c-3

17、p后的Notch2的表達(dá)量相比Normal組和NC組降低了15％。而轉(zhuǎn)染miR-34c-5p后Notch2的表達(dá)量沒有顯著變化。在轉(zhuǎn)染克隆有Notch2基因3'UTR質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)中，miR-34c-3p組與空白組和NC組相比，熒光素酶活性顯著降低(P＜0.05)，證明miR-34c-3p能與Notch2基因3'UTR結(jié)合，從而抑制熒光素酶的活性。miR-34c-3p Inhibitor組與空白組和NCInhibitor組相比，熒光素酶活性

18、顯著升高(P＜0.05)，證明miR-34c-3pInhibitor能封閉內(nèi)源miR-34c-3p，抑制miR-34c-3p的作用。在轉(zhuǎn)染克隆有mut Notch2-2基因3'UTR質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)中，miR-34c-3p組與空白組和NC組均無差異，證明miR-34c-3p不能與mut Notch2-2基因3'UTR結(jié)合，抑制熒光素酶的活性，突變完全。在轉(zhuǎn)染克隆有Notch2基因3'UTR質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)中，miR-34c-5p組與空白組和NC組均

19、無差異，證明miR-34c-5p不能與Notch2基因3'UTR結(jié)合，抑制熒光素酶的活性。同時(shí)在轉(zhuǎn)染克隆有mut Notch2-1基因3'UTR質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)中，miR-34c-5p組與空白組和NC組均無差異，證明miR-34c-5p不能與mut Notch2-1基因3'UTR結(jié)合，抑制熒光素酶的活性。
　　 結(jié)論:轉(zhuǎn)染了miR-34c-3p的膠質(zhì)瘤細(xì)胞其Notch2表達(dá)量明顯降低，而轉(zhuǎn)染miR-34c-5p的沒有顯著變化。利用熒光