內(nèi)皮-單核細(xì)胞激活多肽Ⅱ選擇性增加血腫瘤屏障通透性的作用和機(jī)制.pdf

1、目的：腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤,術(shù)后化療是目前治療腦腫瘤的主要手段。但是由于正常腦組織中血腦屏障(blood-brain barrier,BBB),以及腫瘤組織中血腫瘤屏障(blood-tumor barrier,BTB)的存在,嚴(yán)重限制了抗腫瘤藥物進(jìn)入到腫瘤組織。因此有效地增加腫瘤組織中抗腫瘤藥物的濃度,是提高化療藥物療效的關(guān)鍵。
　　 內(nèi)皮-單核細(xì)胞激活多肽Ⅱ(endothelial-monocyte

2、activating polypeptideⅡ,EMAPⅡ)是從甲基膽蒽A誘導(dǎo)形成的纖維肉瘤細(xì)胞的上清中發(fā)現(xiàn)的致炎因子,具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤血管生成的特性。目前EMAPⅡ主要被用于腫瘤治療的實(shí)驗(yàn)研究。有研究表明低劑量的EMAPⅡ可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞上的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNT)受體1,增加TNFα對(duì)腫瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用,TNFα不僅能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲,還可以在一定程度上增加BBB的

3、通透性。
　　 RhoA/ROCK信號(hào)通路在內(nèi)皮細(xì)胞通透性的改變中起主要的調(diào)控作用,并且絲狀肌動(dòng)蛋白(filamentous actin,F-actin)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的變化是調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的重要機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn),EMAPⅡ可誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白F-actin的重排,使肌動(dòng)蛋白形成廣泛的應(yīng)力纖維和更多的粘著斑。肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的變化能夠影響內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接(tight junction,TJ)復(fù)合體,進(jìn)而影響B(tài)B

4、B的通透性,當(dāng)肌動(dòng)蛋白的應(yīng)力纖維和粘著斑形成增加時(shí),會(huì)通過影響TJ相關(guān)蛋白以及細(xì)胞骨架蛋白開放TJ,從而引起B(yǎng)BB的通透性增加。
　　 本研究的目的是研究EMAPⅡ是否能夠增加腦膠質(zhì)瘤BTB的通透性,以及RhoA/ROCK信號(hào)通路是否參與這一過程。
　　 方法：
　　 1、大鼠C6膠質(zhì)瘤模型和體外BTB模型的制備。
　　 2、應(yīng)用伊文思蘭(evans blue,EB)滲透評(píng)估EMAPⅡ作用后腦膠質(zhì)瘤大鼠B

5、TB滲透性變化。
　　 3、測(cè)量體外BTB模型的跨內(nèi)皮阻抗(transendothelial electric resistance,TEER)值和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)流量,檢測(cè)給予EMAPⅡ作用后以及RhoA特異性抑制劑肉毒梭菌C3胞外酶(Clostridium botulinum C3exoenzyme)和Rho激酶(Rho associated Kinase,ROCK)特異

6、性抑制劑Y-27632預(yù)處理后體外BTB通透性的變化。
　　 4、應(yīng)用RT-PCR、免疫組織化學(xué)法及western blot法檢測(cè)給予EMAPⅡ作用后大鼠C6膠質(zhì)瘤模型中微血管TJ相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的mRNA以及蛋白表達(dá)水平變化。
　　 5、應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)給予EMAPⅡ作用1h后以及C3胞外酶、Y-27632預(yù)處理后,ZO-1、occludin、claudin-5以及F-actin

7、的分布和表達(dá)水平的變化。
　　 6、應(yīng)用western blot法檢測(cè)EMAPⅡ作用后及C3胞外酶、Y-27632預(yù)處理后體外BTB模型上TJ相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的蛋白表達(dá)水平;并且檢測(cè)磷酸化的肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)、肌動(dòng)蛋白素(cofilin)和總MLC、cofilin的表達(dá)。
　　 7、應(yīng)用Pull-down方法檢測(cè)體外BTB模型上EMAPⅡ作用

8、后RhoA活性變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、成功建立了大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型和體外BTB模型。
　　 2、EMAPⅡ作用后,C6腦膠質(zhì)瘤大鼠BTB通透性增加,體外BTB模型的TEER值顯著降低,HRP流量顯著增加。上述指標(biāo)在EMAPⅡ作用1 h時(shí)變化最明顯。體外BTB模型中經(jīng)C3 exoenzyme或Y-27632預(yù)處理后,TEER值以及HRP流量均顯著恢復(fù)。
　　 3、EMAPⅡ作用后,C6腦膠質(zhì)瘤大鼠

9、腦組織中微血管TJ相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的mRNA和蛋白表達(dá)均減少,在1 h時(shí)達(dá)最低值。體外BTB模型中上述蛋白的表達(dá)變化與在體的變化一致。
　　 4、EMAPⅡ作用后,體外BTB模型上的內(nèi)皮細(xì)胞TJ相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5由連續(xù)分布狀態(tài)變?yōu)椴贿B續(xù)分布,ZO-1、occludin和claudin-5在細(xì)胞邊緣表達(dá)水平下降并且發(fā)生由細(xì)胞邊緣向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移;細(xì)胞骨架蛋白F

10、-actin沿細(xì)胞邊緣的分布減少,應(yīng)力纖維增加。C3胞外酶和Y-27632預(yù)處理后,內(nèi)皮細(xì)胞中ZO-1、occludin和claudin-5部分恢復(fù)連續(xù)分布狀態(tài),并且三者的表達(dá)水平顯著恢復(fù);F-actin沿細(xì)胞邊緣的分布明顯增多,應(yīng)力纖維明顯減少。
　　 5、EMAPⅡ作用后,體外BTB模型上的內(nèi)皮細(xì)胞RhoA活性從0.25 h開始增加,0.5 h達(dá)峰值,之后逐漸減少。
　　 6、EMAPⅡ作用后,體外BTB模型上的內(nèi)皮

11、細(xì)胞MLC和cofilin磷酸化水平從0.25 h時(shí)開始增加,1 h時(shí)達(dá)峰值,之后逐漸減少。C3胞外酶或Y-27632預(yù)處理后MLC和cofilin磷酸化水平顯著恢復(fù)。
　　 7、不同病理級(jí)別人腦膠質(zhì)瘤中MMP-7和MMP-14的表達(dá)與ERK1/2的磷酸化顯著正相關(guān)。
　　 討論：
　　 本研究首次證明,EMAPⅡ作用后,BTB通透性顯著增加,TJ相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的mRNA和

12、蛋白表達(dá)均顯著減少,在EMAPⅡ作用1 h達(dá)最低值,TJ相關(guān)蛋白和細(xì)胞骨架蛋白F-actin的分布也發(fā)生改變,并且RhoA活性、MIC和cofilin磷酸化水平顯著升高。應(yīng)用RhoA的特異性抑制劑C3胞外酶和ROCK的特異性抑制劑Y-27632進(jìn)行預(yù)處理后,顯著抑制了BTB的通透性升高,顯著抑制了TJ相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表達(dá)降低,明顯改變了TJ相關(guān)蛋白的重分布和細(xì)胞骨架F-actin的重排,顯著抑制了

13、MLC和cofilin磷酸化水平的升高。上述結(jié)果說明EMAPⅡ能夠通過下調(diào)TJ相關(guān)蛋白ZO-1,occludin和claudin-5的表達(dá)選擇性增加BTB通透性;并且RhoA/ROCK信號(hào)通路在EMAPⅡ介導(dǎo)的BTB通透性增加的過程起重要的調(diào)節(jié)作用;RhoA/ROCK通路的下游信號(hào)分子MLC和cofilin也參與了上述調(diào)節(jié)過程。
　　 以往的研究表明,小劑量緩激肽(bradykinin,BK)能夠有效增加BTB通透性,而不影響正

14、常腦組織。盡管小劑量BK能夠顯著增加BTB通透性,但是其增加BTB通透性的持續(xù)時(shí)間短暫,大約20分鐘。因此,小劑量BK作為一種增加BTB通透性的物質(zhì),其臨床應(yīng)用受到限制。本研究結(jié)果顯示EMAPⅡ作用后,BTB通透性從0.5 h開始增加,在1 h達(dá)到峰值,然后降低,6 h后基本恢復(fù)到未處理前水平。我們發(fā)現(xiàn)EMAPⅡ增加BTB通透性的持續(xù)時(shí)間明顯長(zhǎng)于BK的作用時(shí)間。因此,這一發(fā)現(xiàn)可能為選擇性開放BTB以及增加抗腫瘤藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤組織提供了新

15、方法。
　　 研究表明TJ是維持體內(nèi)BBB完整性的重要結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ),并且在調(diào)節(jié)細(xì)胞旁通透性方面起重要作用。在BBB中,位于內(nèi)皮細(xì)胞之間的TJ復(fù)合物是由如下蛋白組成的,occludin,claudins,Zos和連接粘附分子,這些結(jié)構(gòu)的改變?cè)谡{(diào)節(jié)TJ功能方面起重要作用。最近的研究顯示,F-actin在TJ復(fù)合物的結(jié)構(gòu)支持和功能調(diào)節(jié)方面起重要作用。本研究結(jié)果顯示,EMAPⅡ作用后TJ相關(guān)蛋白ZO-1,occludin和claudi

16、n-5的mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低,最低水平出現(xiàn)在EMAPⅡ作用后1 h,上述TJ相關(guān)蛋白由連續(xù)分布狀態(tài)變?yōu)椴贿B續(xù)分布狀態(tài),發(fā)生由細(xì)胞邊緣向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移;細(xì)胞骨架蛋白F-actin沿細(xì)胞邊緣的分布減少,應(yīng)力纖維增加。因此,我們認(rèn)為EMAPⅡ能夠通過影響細(xì)胞骨架蛋白F-actin的重排進(jìn)而調(diào)節(jié)TJ相關(guān)蛋白ZO-1,occludin和claudin-5的結(jié)構(gòu)和功能,最終引起TJ開放。
　　 研究表明在一些細(xì)胞外刺激下,TJ能發(fā)生快速分

17、解和重組。RhoA/ROCK信號(hào)通路是細(xì)胞外信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞骨架蛋白F-actin重排的分子開關(guān),參與內(nèi)皮細(xì)胞通透性的調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn),EMAPⅡ可誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白F-actin的重排,使肌動(dòng)蛋白形成廣泛的應(yīng)力纖維和更多的粘著斑。當(dāng)肌動(dòng)蛋白的應(yīng)力纖維和粘著斑形成增加時(shí),會(huì)通過影響TJ相關(guān)蛋白以及細(xì)胞骨架蛋白開放TJ,從而引起B(yǎng)BB的通透性增加。本研究結(jié)果顯示EMAPⅡ作用后,RhoA活性、MLC和cofilin磷酸化水平均升高。

18、應(yīng)用RhoA的特異性抑制劑C3胞外酶和ROCK的特異性抑制劑Y-27632進(jìn)行預(yù)處理后,顯著抑制了BTB通透性的升高,顯著抑制了TJ相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5表達(dá)的降低,顯著抑制了TJ相關(guān)蛋白的重分布和細(xì)胞骨架F-actin的重排,顯著抑制了MLC和cofilin磷酸化水平的升高。上述結(jié)果說明RhoA/ROCK-MLC通路和RhoA/ROCK-cofilin通路參與EMAPⅡ介導(dǎo)的細(xì)胞骨架蛋白F-actin重

19、排,TJ相關(guān)蛋白表達(dá)降低及重分布以及BTB通透性增高的過程。
　　 上述結(jié)果證明,EMAPⅡ能夠通過下調(diào)TJ相關(guān)蛋白ZO-1,occludin和claudin-5的表達(dá)選擇性增加BTB通透性,并且RhoA/ROCK信號(hào)通路在EMAPⅡ介導(dǎo)的BTB通透性增加的過程起重要的調(diào)節(jié)作用。RhoA/ROCK通路的下游信號(hào)分子MLC和cofilin也參與了上述調(diào)節(jié)過程。
　　 結(jié)論：
　　 1、EMAPⅡ能夠選擇性增加BTB

20、通透性。
　　 2、EMAPⅡ增加BTB通透性,可能與EMAPⅡ顯著降低TJ相關(guān)蛋白ZO-1,occludin,claudin-5的mRNA和蛋白表達(dá)水平相關(guān)。
　　 3、RhoA/ROCK信號(hào)途徑參與EMAPⅡ選擇性增加BTB通透性的調(diào)節(jié)過程。
　　 4、MLC和cofilin參與EMAPⅡ增加BTB通透性的調(diào)節(jié)過程,且為RhoA/ROCK的下游信號(hào)因子。
　　 5、不同病理級(jí)別人腦膠質(zhì)瘤中MMP-7和