膽紅素對(duì)帕金森病的神經(jīng)保護(hù)作用.pdf

1、帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是最常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病之一，臨床主要表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩及姿態(tài)反射障礙，多數(shù)伴有自主神經(jīng)功能障礙。隨著我國(guó)人口老齡化進(jìn)程的加快，PD的發(fā)病率日益增高，發(fā)病人數(shù)逐年增加，目前我國(guó)的PD患者已超過(guò)200萬(wàn)?，F(xiàn)階段PD的治療存在著局限性，無(wú)根本性治療方法，遠(yuǎn)期療效差，PD將勢(shì)必影響我國(guó)老年人群的生活質(zhì)量，給患者、家庭和社會(huì)造成嚴(yán)重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，解析PD發(fā)病機(jī)理以

2、及尋找疾病的治療新策略尤為重要。黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元變性壞死是PD的病理特征，其原因尚不清楚，目前普遍認(rèn)為氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙在其中起著重要的作用。因此抗氧化劑在PD發(fā)病和治療中的作用日益引起人們的重視，成為研究熱點(diǎn)。
　　膽紅素是血紅素的代謝終產(chǎn)物，在傳統(tǒng)觀念中被認(rèn)為是代謝廢物，具有毒性作用。但是越來(lái)越多的研究顯示膽紅素是體內(nèi)唯一內(nèi)源性溶脂性抗氧化劑，具有強(qiáng)大的抗氧化、抗炎作用。膽紅素與冠心病和糖尿病等疾病的發(fā)病關(guān)系已經(jīng)得到

3、了一定的證實(shí)。膽紅素對(duì)神經(jīng)元和海馬組織具有抗氧化神經(jīng)保護(hù)作用。但是膽紅素與PD發(fā)病的關(guān)系以及對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　本研究擬通過(guò)回顧性病例資料分析探尋膽紅素與PD發(fā)病的可能關(guān)系。并進(jìn)一步建立體外PD細(xì)胞模型，從細(xì)胞水平上評(píng)判膽紅素對(duì)PD的作用及可能機(jī)制。
　　第一部分,帕金森病患者血清膽紅素、尿酸和血脂水平的觀察
　　目的：觀察分析帕金森病患者血清膽紅素（IBIL）、尿酸（UA）和血脂（TCH, TG,

4、 HDL-C, LDL-C）水平，探討膽紅素與PD的可能關(guān)系。
　　方法：選取徐州市中心醫(yī)院2006年1月-2012年9月的住院及門診患者PD患者250例作為PD組，同時(shí)以同期體檢中心隨機(jī)選取年齡配對(duì)的259名健康體檢人群為對(duì)照組，檢測(cè)并記錄血清膽紅素（IBIL），尿酸及血脂（TCH、TG、HDL-C和LDL-C）水平，進(jìn)行對(duì)比分析。
　　結(jié)果：PD組血清IBIL水平（8.36±2.80μM ol/L）明顯低于對(duì)照組比（9.

5、15±2.58μM ol/L）（P=0.015）; PD組UA水平（241.26±59.45μMol/L）亦明顯低于對(duì)照組（300.09±60.06μMol/L）（P=0.000）。PD女性亞組IBIL水平顯著低于男性亞組，分別為（7.70±2.69μMol/L）和（8.71±2.82μMol/L）；女性亞組UA水平亦顯著低于男性亞組，分別為（215.11±57.99μMol/L）和（254.97±55.80μMol/L）（P＜0.05

6、）。PD各年齡亞組和各H&Y分級(jí)亞組IBIL和UA水平無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。對(duì)照組IBIL與UA有顯著正相關(guān)性（r=0.229，P＜0.01），而PD組IBIL與UA無(wú)顯著相關(guān)性（r=-0.032， P＞0.05）。
　　PD患者TCH水平顯著低于對(duì)照組，分別為（4.44±0.87 mmol/L）和（4.94±0.90 mmol/L）（P＜0.05）；PD患者LDL-C水平顯著低于對(duì)照組，分別為（2.66±0.70 mmo

7、l/L）和（3.21±0.84 mmol/L）（P＜0.05）；而PD患者TG水平、HDL-C水平無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。PD組男性亞組TCH水平顯著低于女性亞組，分別為（4.26±0.76 mmol/L）和（4.79±0.95 mmol/L）（P＜0.05）；男性LDL-C水平顯著低于女性，分別為（2.55±0.62 mmol/L）和（2.86±0.81 mmol/L）（P＜0.05）。PD組不同年齡亞組及不同H&Y分級(jí)亞組TC

8、H、TG、HDL-C和LDL-C水平無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：PD患者血清IBIL和UA水平顯著降低，PD組女性IBIL和UA水平較男性顯著降低。IBIL和UA水平與患者年齡和病情嚴(yán)重程度無(wú)相關(guān)性。健康人群中IBIL與UA水平正相關(guān)，而PD患者IBIL與UA水平無(wú)相關(guān)性。PD患者血清TCH和LDL-C水平顯著降低，男性患者更低于女性患者。
　　第二部分,膽紅素預(yù)處理減輕6-OHDA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷作

9、用
　　目的：明確膽紅素預(yù)處理減輕能否減輕6-OHDA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷作用。 方法：利用6-OHDA和SH-SY5Y細(xì)胞建立體外PD細(xì)胞模型，觀察不同濃度6-OHDA作用24h對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)、MTT還原率和LDH釋放的影響；觀察不同濃度膽紅素作用4h、24h、48h對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)、MTT還原率和LDH釋放的影響。以此篩選出6-OHDA和SH-SY5Y細(xì)胞適宜的培養(yǎng)濃度和培養(yǎng)時(shí)間。最后以篩選出的

10、適宜濃度膽紅素預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞（處理時(shí)間為篩選出的適宜時(shí)間），再予篩選出的適宜濃度6-OHDA作用于SH-SY5Y細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)，檢測(cè)MTT還原率和LDH釋放。
　　結(jié)果：25μM、50μM、100μM，150μM，200μM濃度6-OHDA作用于SH-SY5Y細(xì)胞24h后，與對(duì)照組相比MTT還原率顯著降低， LDH釋放量顯著升高（P＜0.05），并且隨著作用濃度的升高而逐漸改變。6-OHDA可使細(xì)胞活性降低，胞膜完整

11、性破壞。
　　1μM、5μM、10μM、15μM、30μM濃度膽紅素分別作用于SH-SY5Y細(xì)胞4h，30μM組細(xì)胞MTT還原率明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）；作用24h：10μM組MTT還原率升高， LDH釋放量也顯著降低（P＜0.05，VS對(duì)照組&4h）；30μM組MTT還原率明顯降低， LDH釋放量顯著增高（P＜0.05，VS對(duì)照組&4h）。作用48h：1μM、5μM、10μM組細(xì)胞活性顯著升高，LDH釋放量也顯著降低（P＜

12、0.05，VS對(duì)照組&24h），尤其以10μM組細(xì)胞變化更明顯；30μM組細(xì)胞活性明顯降低，LDH釋放量顯著增高（P＜0.05，VS對(duì)照組&24h
　　根據(jù)上述結(jié)果，設(shè)置對(duì)照組（不加膽紅素，也不加6-OHDA）、未處理組（不加膽紅素，0μM）、1μM、5μM、10μM、15μM、30μM濃度膽紅素預(yù)處理4h，100μM6-OHDA作用SH-SY5Y細(xì)胞24h，檢測(cè)MTT還原率和LDH釋放量。與未處理組相比，1μM、5μM、10μM

13、膽紅素預(yù)處理4h，MTT還原率顯著增高，LDH釋放量顯著減少（P＜0.05）。
　　結(jié)論：6-OHDA可誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生損傷，其損傷作用呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。30μM膽紅素對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞有毒性作用。10μM膽紅素預(yù)處理可以顯著減輕6-OHDA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷作用。
　　第三部分,膽紅素減輕6-OHDA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞損傷作用的機(jī)制研究
　　目的：探討膽紅素預(yù)處理減輕6-OHDA對(duì)SH-SY

14、5Y細(xì)胞損傷作用的機(jī)制。
　　方法：予10μM濃度膽紅素預(yù)處理4h，100μM6-OHDA作用SH-SY5Y細(xì)胞24h，分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA水平；SOD活性和GSH水平；以及Caspase-3活性和凋亡細(xì)胞數(shù)量。對(duì)照組不予膽紅素預(yù)處理，代之以等量NaOH，也不加6-OHDA誘導(dǎo)，代之以等量PBS。未處理組：不加膽紅素（0μM），代之以等量NaOH。
　　結(jié)果：對(duì)照組、未處理組和預(yù)處理組細(xì)胞內(nèi)ROS水平分別為：1±0.

15、23、2.56±0.75和1.69±0.35；MDA水平分別為：0.56±0.24 nmol/mgprot、2.07±0.32 nmol/mgprot和1.39±0.23 nmol/mgprot；SOD活性分別為：24.35±1.27 U/L、10.53±1.35 U/L和16.15±1.72 U/L；GSH水平分別為：10.19±1.67μMol/g、2.98±0.75μMol/g和5.79±1.30μMol/g；Caspase-3活

16、性分別為：1±0.24、1.89±0.55和1.46±0.22；凋亡細(xì)胞比例分別為：4.47±0.35%、10.74±0.95%和7.05±0.56%。與對(duì)照組比較，未處理組和預(yù)處理組細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA水平顯著升高（P＜0.05），SOD活性和GSH水平顯著降低（P＜0.05）。Caspase-3活性顯著增強(qiáng)，凋亡細(xì)胞比例顯著增多（P＜0.05）。預(yù)處理組與未處理組相比，ROS和MDA水平顯著降低，SOD活性和GSH水平顯著升高。Ca

17、spase-3活性顯著降低，凋亡細(xì)胞比例顯著減少。
　　結(jié)論：6-OHDA的毒性作用表現(xiàn)為使細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA水平顯著升高；SOD活性和GSH水平顯著降低；Caspase-3活性顯著增強(qiáng)，凋亡細(xì)胞比例顯著增多。10μM膽紅素預(yù)處理可通過(guò)降低氧化物質(zhì)ROS和脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA水平，提高抗氧化物質(zhì)SOD活性和GSH水平，降低Caspase-3活性顯著增強(qiáng)，減少凋亡細(xì)胞比例，明顯減輕6-OHDA的毒性作用。
　　結(jié)論
　　

18、1．PD患者血清IBIl和UA水平均下降，提示膽紅素可能和UA一樣參與了PD的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中。
　　2.30μM膽紅素對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞有毒性作用，10μM膽紅素預(yù)處理可以減輕6-OHDA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用，對(duì)PD細(xì)胞模型具有神經(jīng)保護(hù)作用。
　　3.膽紅素可減緩6-OHDA介導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA升高和Caspase活性增強(qiáng)，提高SOD活性和GSH含量，減少凋亡的發(fā)生。
　　4.膽紅素可