瘦素對帕金森病神經(jīng)損傷的保護和機制初探.pdf

1、帕金森病(Parkinson’s diseases, PD)的病理變化為中腦黑質區(qū)多巴胺能神經(jīng)元變性、死亡、缺失,黑質-紋狀體多巴胺能系統(tǒng)功能減退,并在殘存神經(jīng)元呈現(xiàn)α-突觸核蛋白(α-synuclein)和泛素染色陽性的胞漿包涵體體形成。因此尋找有效的神經(jīng)保護因子,對帕金森病的發(fā)病進程進行干預,進而減輕神經(jīng)損傷、恢復神經(jīng)功能,這是目前研究關注的熱點。
　　瘦素(Leptin)作為一種能量代謝調節(jié)因子,在炎癥反應和創(chuàng)傷修復方面也具

2、有重要功能。最近有關其神經(jīng)保護作用的研究越來越多,但對其作用機制的研究還知之甚少,尤其是在帕金森病的研究領域。為了解瘦素在帕金森病中的作用及其病理生理機制,本研究擬通過帕金森病患者的血樣分析,探討瘦素對帕金森病的關聯(lián)性,并建立6-OHDA誘導C57BL/6J小鼠的帕金森動物模型,6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)和魚藤酮( Rotenone)誘導多巴胺能樣細胞系SH-SY5Y細胞的帕金森病細胞模型來探討瘦

3、素對帕金森病神經(jīng)損傷的保護以及機制。
　　本課題包括以下三個部分工作:
　　第一部分帕金森病患者血清瘦素及其受體,以及氧化應激的變化
　　目的:探討血清中的leptin和可溶性瘦素受體(Soluble leptin receptor, sObR)水平,以及氧化和抗氧化指標與帕金森病的關系性;方法:1.檢測健康人群(年齡范圍平均)人的leptin和sObR水平;2.檢測PD患者和對照組(主要老年群體)中的leptin和s

4、ObR水平,檢測兩個群體中的丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)和還原型谷胱甘肽(Glutathione, GSH)的水平;3.分析leptin和sObR水平與帕金森病的相關性,以及與年齡的相關性,與男女性別的相關性;4.分析MDA、GSH以及SOD的水平與帕金森的相關性,以及和leptin與sObR的相關性。結果:1.隨著年齡的增加,leptin的水平

5、有所增加但是在40歲左右穩(wěn)定,sObR變化不大;2.帕金森病患者相對于對照組(老年群體), MDA和sObR水平有所增加,但leptin、SOD和GSH水平有所下降(P<0.05);3.女性的leptin水平高于男性,sObR水平低于男性(P<0.05);4. GSH和SOD與leptin水平呈正相關,與sObR呈負相關;MDA與leptin水平呈負相關,與sObR呈正相關。結論:1.帕金森患者中,血清中氧化應激水平高,leptin水平

6、低,sObR水平高;2.保持較高的血清leptin水平,有降低患帕金森病風險的可能性。
　　第二部分瘦素對帕金森病動物模型黑質區(qū)域的保護
　　目的:在建立的PD動物模型基礎上,觀察leptin對于黑質區(qū)域損傷的保護,以及下游氧化應激水平的變化。方法:①建立6-OHDA誘導的右側損傷的 PD動物模型,假手術組(對照組),模型組,模型+leptin組,模型+leptin+nanobody組,通過皮下注射阿撲嗎啡,通過向左側旋轉次

7、數(shù)鑒定動物模型是否建立成功;②免疫組化檢測各組中腦黑質區(qū)多巴胺能神經(jīng)元特異性蛋白酪氨酸羥化酶的變化;③收集各組血清,檢測MDA、GSH和SOD的變化。結果:1.阿撲嗎啡皮下注射后,模型組相對于對照組,左側旋轉次數(shù)顯著增加,模型+leptin組旋轉次數(shù)減少,加入nanobody后,旋轉次數(shù)右顯著增加;2.模型組及模型+leptin+nanobody組右側黑質區(qū)域多巴胺能相對于左側明顯減少,模型+leptin組右側黑質區(qū)域多巴胺能相對于左側

8、有所減少,但較模型組和加入 nanobody組有所增加。3.各組血清中,模型組相對于對照組MDA有所增加,GSH和SOD有所減少,模型+leptin組相對于模型組和 leptin+nanobody組,MDA有所減少,GSH和 SOD有所增加。結論:1.外源性Leptin能夠減少PD的嚴重程度,能夠減少多巴胺能神經(jīng)元的丟失;2. Leptin在PD動物模型中,可顯著降低血清中MDA水平,升高SOD和GSH水平,在阻斷脂質過氧化,增加抗氧化

9、性,維持機體氧化平衡的穩(wěn)定具有積極作用。
　　第三部分瘦素減輕6-羥基多巴胺和魚藤酮誘導的SH-SY5Y細胞損傷的機制研究
　　目的:通過6-OHDA和rotenone誘導SH-SY5Y的帕金森病細胞模型,對leptin的神經(jīng)保護作用及機制進行探討。方法:6-OHDA和rotenone去誘導SH-SY5Y。①CCK-8和LDH分別檢測不同濃度6-OHDA和rotenone誘導SH-SY5Y細胞的存活率和損傷率;②CCK-8、

10、LDH、臺盼藍和流式細胞術分別檢測 leptin對于100μmol/L6-OHDA和5μmol/Lrotenone誘導SH-SY5Y細胞的存活、損傷、死亡以及凋亡的影響,以及其受體阻斷劑 nanobody的影響。③熒光探針檢測,leptin對于6-OHDA和rotenone損傷導致ATP和ROS變化的影響,以及,免疫熒光和Western blot檢測和cleaved caspase-3的變化。④Nanobody加入后,檢測相關細胞裂解液

11、中的SOD、MDA和GSH這些氧化性和抗氧化性指標的變化。⑤CCK-8檢測,AG490、nanobody、LY294002、compound C、U0126、ZnPP,對于leptin對于6-OHDA和rotenone損傷減輕的影響,并比較LiCl和CoPP對細胞的保護。⑥Leptin模型保護加入LY294002、compound C和U0126后,Western blot檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax,以及相關通路分子p-Akt,

12、p-ERK1/2,p-AMPK,p-GSK3β,HO-1,Western blot及RT-PCR檢測帕金森相關蛋白,RT-PCR檢測α-synuclein的mRNA水平。Western blot檢測LiCl和CoPP對于模型組Bcl-2、Bax以及HO-1的表達影響。結果:1. Leptin提高了SH-SY5Y細胞的存活率,降低了損傷率及凋亡率;2.相應的阻斷劑加入后, leptin的保護作用均有所減弱;3. Leptin提高了ATP的

13、增加,降低了ROS的水平。4. Nanobody加入,逆轉了leptin引起的MDA的降低,SOD和GSH的升高;5. Leptin提高了Bcl-2和HO-1的表達,降低了cleaved caspase-3、Bax和α-synuclein的表達,并且提高了 p-Akt、p-ERK1/2、p-AMPK以及 p-GSK3β的水平,阻斷劑的加入部分逆轉了leptin的影響,相應蛋白的阻斷劑都降低了p-GSK3β的水平,并降低了leptin提高