TLR4單克隆抗體對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠急性期潰瘍性結(jié)腸炎干預(yù)作用的研究.pdf

1、第一部分 TLR4mAb對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠急性期潰瘍性結(jié)腸炎癥狀及病理改變的影響
　　 目的:觀察TLR4單克隆抗體對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠急性期潰瘍性結(jié)腸炎的干預(yù)作用。
　　 方法:30只BALB/c小鼠分為A～E組:對(duì)照組(A組)、模型組(B組)以及低、中、高劑量干預(yù)組(C組、D組、E組)。A組小鼠飲用蒸餾水7天；B—E組小鼠僅飲用5％DSS水溶液7天以產(chǎn)生急性期潰瘍性結(jié)腸炎模型。造模的同時(shí),分別給三組干預(yù)組小鼠以

2、低、中、高劑量TLR4mAb(2μg/只/48h、10μg/只/48h、20μg/只/48h)腹腔內(nèi)注射以觀察干預(yù)作用。觀察指標(biāo)包括疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)；結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分(HPS)。
　　 結(jié)果:造模結(jié)束時(shí),模型組產(chǎn)生典型腹瀉、血便等潰瘍性結(jié)腸炎表現(xiàn)。對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組的DAI分別為0.33±0.15、7.00±2.53、6.50±1.05、4.33±2.80、1.83±2.04,其中低、中、高劑量

3、組DAI呈逐步遞減。模型組DAI明顯高于對(duì)照組；高劑量組DAI與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中、低劑量組DAI與模型組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組的HPS分別為6.00±0.89、13.50±0.55、13.33±0.52、8.00±0.89、6.83±0.41,其中低、中、高劑量組HPS呈逐步遞減。模型組HPS明顯高于對(duì)照組；高劑量組HPS與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中劑量組HPS明顯小于模型組；低劑量

4、組HPS與模型組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:TLR4mAb可以減輕葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠急性期潰瘍性結(jié)腸炎的疾病活動(dòng)指數(shù)及病理炎癥改變,具有干預(yù)作用。
　　 第二部分 TLR4mAb對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠急性期潰瘍性結(jié)腸炎黏膜細(xì)胞因子的影響
　　 目的:觀察TLR4mAb對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠急性期潰瘍性結(jié)腸炎黏膜細(xì)胞因子IL-17、IL-10及TGF—β的影響,探討TLR4mAb干預(yù)作用的作用機(jī)制。
　　

5、 方法:造模及干預(yù)方法同第一部分。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組腸黏膜細(xì)胞因子IL—17、IL—10及TGF—β的mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果:對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠腸黏膜IL—17mRNA表達(dá)量如下:0.01±0.004、0.33±0.175、0.14±0.018、0.07±0.032、0.03±0.006。模型組mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組；中、高劑量組mRNA表達(dá)明顯低于模型組,與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

6、。
　　 對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠腸黏膜IL-10mRNA表達(dá)量如下:0.08±0.016、2.39±0.247、1.33±0.160、0.50±0.115、0.20±0.104。模型組mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組；低、中、高劑量組mRNA表達(dá)明顯低于模型組,高劑量組mRNA表達(dá)與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；低、中、高劑量組中mRNA表達(dá)量遞減,呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系。
　　 對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組、

7、高劑量組小鼠腸黏膜TGF—β mRNA表達(dá)量如下:0.48±0.039、6.02±0.989、3.93±0.594、1.75±0.448、0.70±0.124。模型組mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組；低、中、高劑量組蛋白表達(dá)明顯低于模型組,高劑量組mRNA表達(dá)與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;低、中、高劑量組中mRNA表達(dá)量遞減,呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系。
　　 結(jié)論:潰瘍性結(jié)腸炎腸道黏膜中促炎因子分泌過(guò)多,抑炎因子分泌代償性增加,但仍相對(duì)不足,存在促炎

8、/抑炎因子失衡,使黏膜產(chǎn)生過(guò)強(qiáng)的炎癥反應(yīng),引起腸道損傷。TLR4mAb干預(yù)后細(xì)胞因子IL—17及抑炎因子IL—10、TGF—β的表達(dá)均下調(diào),提示TLR4mAb可以抑制腸道免疫的過(guò)度激活,減少炎癥因子的過(guò)度表達(dá),從而反饋性下調(diào)抑炎細(xì)胞因子的表達(dá),打破促炎/抑炎因子的失衡狀態(tài),減輕急性期潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥表現(xiàn)。
　　 第三部分 TLR4mAb對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠急性期潰瘍性結(jié)腸炎TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路的影響
　　 目的:觀

9、察TLR4mAb對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠急性期潰瘍性結(jié)腸炎TLR4介導(dǎo)的兩條通路:NF—κB通路和MAPKs通路中關(guān)鍵蛋白磷酸化ERK1/2、磷酸化JNK1、磷酸化IKK的表達(dá)及NF-κB活性的影響,進(jìn)一步探討TLR4mAb干預(yù)作用的作用機(jī)制。
　　 方法:造模及干預(yù)方法同第一部分。用Western Blot免疫印跡法方法測(cè)定各組腸黏膜磷酸化ERK1/2、磷酸化JNK1、磷酸化IKK的蛋白表達(dá)；用EMSA方法檢測(cè)NF-κB的活性

10、。
　　 結(jié)果:對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠腸黏膜磷酸化ERK1/2的蛋白表達(dá)量如下:0.10±0.000、0.84±0.075、0.73±0.015、0.42±0.017、0.28±0.017。模型組蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組；低、中、高劑量組蛋白表達(dá)明顯低于模型組,但高于對(duì)照組；低、中、高劑量組中蛋白表達(dá)量遞減,呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系。
　　 對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠腸黏膜磷酸化JN

11、K1的蛋白表達(dá)量如下:0.11±0.000、0.81±0.066、0.63±0.006、0.46±0.032、0.27±0.015。模型組蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組；低、中、高劑量組蛋白表達(dá)明顯低于模型組,但高于對(duì)照組；低、中、高劑量組中蛋白表達(dá)量遞減,呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系。
　　 對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠腸黏膜磷酸化IKK的蛋白表達(dá)量如下:0.16±0.006、0.91±0.047、0.83±0.017、0.5

12、0±0.031、0.37±0.045;模型組蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組；低、中、高劑量組蛋白表達(dá)明顯低于模型組,但高于對(duì)照組；低、中、高劑量組中蛋白表達(dá)量遞減,呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系。
　　 對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠腸黏膜NF-κB的活性如下:4.97±3.04、22.65±6.56、17.38±5.73、13.80±4.37、11.10±3.28。模型組蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組；中、高劑量組蛋白表達(dá)明顯低于模型組,