腸粘膜淋巴細(xì)胞對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的作用研究.pdf

1、本課題以多次低劑量口服CEP對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)BALB/c小鼠結(jié)腸炎的預(yù)防模型為基礎(chǔ)，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞亞群CD8α+和TCRγδ+T細(xì)胞在腸相關(guān)淋巴組織及脾中的改變，探討T細(xì)胞亞群在DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎中的作用以及T細(xì)胞亞群在口服耐受干預(yù)結(jié)腸炎中的作用，同時(shí)過(guò)繼轉(zhuǎn)移來(lái)自未處理小鼠或口服耐受處理小鼠的小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(SI-IEL)及經(jīng)磁性活化細(xì)胞分選技術(shù)分選的SI-γδ IEL，觀察受體鼠結(jié)腸炎的癥狀及組織學(xué)病變，并初步探索細(xì)胞作

2、用的機(jī)制，為IBD的發(fā)病機(jī)制及臨床治療提供新的依據(jù)。
　　 第一部分：小鼠結(jié)腸炎的改善與結(jié)腸粘膜中CD8α+和TCRγδ+T細(xì)胞增多相關(guān)
　　 為建立BALB/c小鼠結(jié)腸炎，予7周齡雄性小鼠自由飲用4％DSS，每日監(jiān)測(cè)疾病活動(dòng)指數(shù)，7日后取脾曲至肛門的腸段用于組織學(xué)評(píng)分。結(jié)果表明結(jié)腸炎小鼠的第7日疾病活動(dòng)指數(shù)和組織學(xué)評(píng)分均較未處理對(duì)照鼠顯著升高。
　　 取結(jié)腸炎誘導(dǎo)7日后小鼠的結(jié)腸標(biāo)本，制備結(jié)腸炎提取蛋白。以每只

3、200μl1.25 mg/ml CEP灌胃6周齡小鼠，隔日1次，共5次。以等濃度等量牛血清白蛋白灌胃為對(duì)照。于末次灌胃后休息3天開(kāi)始用4％DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎，評(píng)估兩組小鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)及病理學(xué)改變。從結(jié)腸炎誘導(dǎo)第4日至第7日，口服CEP結(jié)腸炎小鼠的DAI顯著低于口服BSA結(jié)腸炎小鼠。兩組的組織學(xué)評(píng)分具有顯著性差異，表明口服五次低劑量CEP能緩解DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。Spearman分析顯示組織學(xué)評(píng)分與第7日疾病活動(dòng)指數(shù)相關(guān)。
　　

4、收集未處理小鼠、結(jié)腸炎小鼠、口服CEP結(jié)腸炎小鼠、口服BSA結(jié)腸炎小鼠的血清，ELISA法檢測(cè)血清中TGF-β1和IFN-γ的濃度。結(jié)果示結(jié)腸炎小鼠血清中的TGF-β1濃度低于未處理鼠，與口服BSA對(duì)照鼠相比，口服CEP結(jié)腸炎小鼠血清中的TGF-β1有2至3倍的增加。然而，血清IFN-γ濃度在各組小鼠之間未見(jiàn)明顯差異。
　　 然后，我們重建結(jié)腸炎模型、口服CEP模型及對(duì)照組，提取小腸和大腸的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、固有層淋巴細(xì)胞、脾細(xì)胞

5、、派氏集合淋巴結(jié)及腸系膜淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠中CD3+、TCRγδ+、CD8α+和CD8α+TCRγδ+T細(xì)胞的改變。
　　 與未處理組相比，結(jié)腸炎小鼠SI-IEL和SI-LPL的TCRγδ+和CD8α+TCRγδ+T細(xì)胞的比例增加，相應(yīng)的TCRγδ- T細(xì)胞和CD8α+TCRγδ- T細(xì)胞的比例降低。與口服BSA結(jié)腸炎對(duì)照組相比，口服CEP結(jié)腸炎小鼠LI-IEL和LI-LPL的TCRγδ+T細(xì)胞、CD8

6、α+TCRγδ+T細(xì)胞、CD8α+T細(xì)胞和CD8α+TCRγδ- T細(xì)胞的比例均增加，相應(yīng)的TCRγδ- T細(xì)胞和CD8α-TCRγδ- T細(xì)胞的比例降低。第7日的DAI與大腸粘膜中CD8α+T細(xì)胞或TCRγδ+T細(xì)胞的百分比之間呈負(fù)相關(guān)。
　　 口服CEP結(jié)腸炎小鼠的結(jié)果表明結(jié)腸炎的改善伴隨大腸粘膜淋巴細(xì)胞中CD8α+T細(xì)胞和TCRγδ+T細(xì)胞的增多，因此我們檢測(cè)DSS處理終止5日的修復(fù)期小鼠的腸粘膜淋巴細(xì)胞。與未處理對(duì)照組相

7、比，結(jié)腸炎修復(fù)期小鼠LI-IEL和LI-LPL的TCRγδ+T細(xì)胞、CD8α+TCRγδ+T細(xì)胞、CD8α+T細(xì)胞和CD8α+TCRγδT細(xì)胞的比例均增加，相應(yīng)的TCRγδ- T細(xì)胞和CD8α-TCRγδ- T細(xì)胞的比例降低。
　　 口服CEP結(jié)腸炎小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD8α+T細(xì)胞的比例高于口服BSA結(jié)腸炎小鼠。PP的CD3+T細(xì)胞在結(jié)腸炎小鼠中的比例高于未處理鼠，CD8α+T細(xì)胞的比例亦增多，口服CEP結(jié)腸炎小鼠的PP中CD3

8、+T細(xì)胞和CD8α+T細(xì)胞的比例均低于口服BSA結(jié)腸炎小鼠。與PP中細(xì)胞的變化模式相反，MLN的CD3+T細(xì)胞在結(jié)腸炎小鼠中的比例低于未處理鼠，CD8α+T細(xì)胞的比例亦減少，口服CEP結(jié)腸炎小鼠的腸系膜淋巴結(jié)中CD3+T細(xì)胞和CD8α+T細(xì)胞的比例均高于口服BSA結(jié)腸炎小鼠。
　　 總之，口服多次低劑量CEP能緩解DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，口服抗原致結(jié)腸炎的改善與大腸粘膜淋巴細(xì)胞中CD8α+T細(xì)胞和TCRγδ+T細(xì)胞的比例增多相關(guān)，修

9、復(fù)期粘膜的修復(fù)也伴隨大腸粘膜淋巴細(xì)胞中CD8α+T細(xì)胞和TCRγδ+T細(xì)胞比例的增多，提示腸粘膜CD8α+T細(xì)胞和TCRγδ+T細(xì)胞在DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎中具有保護(hù)性調(diào)節(jié)作用?？诜褪苷T導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞中CD8α+T細(xì)胞增多。PP與MLN中的T細(xì)胞在DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎及口服耐受中發(fā)揮不同的作用。
　　 第二部分：小腸上皮內(nèi)γδ T細(xì)胞的提純
　　 γδT細(xì)胞在外周血及大多數(shù)淋巴器官中比例較少，但富集于上皮組織如腸上皮內(nèi)，該部分主要

10、建立BALB/c小鼠小腸上皮內(nèi)γδT細(xì)胞的提純過(guò)程。
　　 取BALB/c小鼠的小腸，外翻并振蕩，以離散上皮組織。在一部分實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞懸液直接用40％/70％不連續(xù)Percoll離心，在另一部分實(shí)驗(yàn)中，離散上皮首先用10ml的30％Percoll離心，去除大部分上皮細(xì)胞，然后用40％/70％不連續(xù)Percoll離心。利用兩步Percoll離心獲取SI-IEL的總過(guò)程耗時(shí)約2小時(shí)，而一步提純法則縮短半小時(shí)左右時(shí)間。對(duì)每組8份提取細(xì)

11、胞的分析顯示：一步40％/70％Percoll離心后純度約88.8％，兩步30％/40％/70％Percoll離心后純度約93.2％，兩組之間存在顯著性差異，污染的細(xì)胞主要為上皮細(xì)胞。然而在細(xì)胞量方面未見(jiàn)明顯差異，一步Percoll離心后細(xì)胞產(chǎn)量為0.81-1.48×107不等，平均1.141×107細(xì)胞，兩步Percoll離心后細(xì)胞產(chǎn)量為0.92-1.34×107不等，平均1.123×107細(xì)胞。利用三色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SI-IEL中C

12、D3+、TCRγδ+、CD8α+和CD8α+TCRγδ+T細(xì)胞的比例。SI-IEL主要由T細(xì)胞構(gòu)成，而且絕大多數(shù)是CD8α+T細(xì)胞。CD3+T細(xì)胞中，TCRγδ+T細(xì)胞占了較高的比例，大約占30-50％，TCRγδ+T細(xì)胞中大約90％是CD8α+的。兩種Percoll提純的細(xì)胞也被用于流式檢測(cè)，結(jié)果表明兩組之間細(xì)胞亞群的構(gòu)成無(wú)顯著差異。
　　 利用MACS分選兩步Percoll提純的SI-IEL中的γδT細(xì)胞。在這個(gè)過(guò)程中，抗體

13、和微珠的量需要經(jīng)過(guò)優(yōu)化處理，以獲得足夠的純度和產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1.5×107細(xì)胞用3μg PE-conjugated anti-TCRδ-chain抗體染色，45ul anti-PE微珠分選能獲得95％以上的純度。經(jīng)包被的anti-CD3ε抗體刺激，SI-IEL比分選的γδ T細(xì)胞分泌更多的IFN-γ和TGF-β1，γδ T細(xì)胞產(chǎn)生中等量的TGF-β1和極少量的IFN-γ。
　　 總之，我們建立的SI-IEL分離程序是可依賴的

14、簡(jiǎn)單的方法，獲得的細(xì)胞純度高及細(xì)胞量多。利用一步40％/70％ Percoll提純法可以少費(fèi)力，足以用于細(xì)胞亞群的表型分析。先用10ml的30％ Percoll離心再用40％/70％ Percoll提純法獲得的細(xì)胞適合用MACS技術(shù)分選出γδ T細(xì)胞，從而為表型及功能研究奠定基礎(chǔ)。
　　 第三部分：小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的保護(hù)作用
　　 為進(jìn)一步研究SI-IEL及γδ T細(xì)胞對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎

15、的作用，來(lái)自未處理鼠、結(jié)腸炎鼠、口服CEP結(jié)腸炎鼠及口服BSA結(jié)腸炎鼠的SI-IEL3×106或SI-γδIEL9×105重懸在150μl PBS中，通過(guò)尾靜脈注射至受體鼠，以注射PBS作為空白對(duì)照組，然后受體鼠自由飲用4％ DSS7日以誘導(dǎo)結(jié)腸炎，評(píng)估受體鼠的DAI和組織學(xué)評(píng)分。結(jié)果顯示來(lái)自未處理小鼠及結(jié)腸炎小鼠的SI-IEL或分選的γδT細(xì)胞的轉(zhuǎn)移均能緩解受體鼠的結(jié)腸炎，來(lái)自口服CEP及BSA結(jié)腸炎小鼠的小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞或分選的γ

16、δ T細(xì)胞的轉(zhuǎn)移均能緩解受體鼠的結(jié)腸炎，來(lái)自口服CEP結(jié)腸炎鼠的SI-IEL的保護(hù)效果強(qiáng)于來(lái)自口服BSA結(jié)腸炎小鼠的SI-IEL。轉(zhuǎn)移各種SI-IEL的受體結(jié)腸炎鼠的DAI及組織學(xué)評(píng)分在第7日與轉(zhuǎn)移SI-γδ IEL的受體結(jié)腸炎鼠相比均有所減少，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 經(jīng)包被的anti-CD3ε抗體刺激，來(lái)自口服CEP結(jié)腸炎鼠的SI-IEL和分選的γδT細(xì)胞比來(lái)自口服BSA結(jié)腸炎鼠的細(xì)胞分泌更多的TGF-β1。來(lái)自未處理鼠與

17、結(jié)腸炎鼠之間、來(lái)自口服CEP與口服BSA結(jié)腸炎鼠之間的SI-IEL和γδ T細(xì)胞分泌的IFN-γ無(wú)顯著差異。細(xì)胞轉(zhuǎn)移的受體鼠用于檢測(cè)血清中TGF-β1和IFN-γ的水平。與PBS對(duì)照組相比，細(xì)胞的轉(zhuǎn)移包括來(lái)自未處理鼠、結(jié)腸炎鼠、口服CEP結(jié)腸炎鼠、口服BSA結(jié)腸炎鼠的SI-IEL或分選的γδ T細(xì)胞，均引起受體鼠血清中TGF-β1水平提高2-3倍。血清TGF-β1的濃度與結(jié)腸炎體重下降百分比或組織學(xué)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。轉(zhuǎn)移口服CEP結(jié)腸炎鼠S

18、I-IEL的受體鼠比轉(zhuǎn)移口服BSA結(jié)腸炎鼠SI-IEL的受體鼠擁有更高濃度的TGF-β1。血清IFN-γ在細(xì)胞轉(zhuǎn)移受體鼠與PBS對(duì)照組之間均無(wú)明顯差異。體外培養(yǎng)顯示SI-IEL對(duì)anti-CD3ε抗體和Con A刺激均無(wú)明顯增殖。
　　 總之，SI-IEL及分選的γδ T細(xì)胞對(duì)DSS誘導(dǎo)的BALB/c小鼠結(jié)腸炎具有保護(hù)作用，口服耐受加強(qiáng)了SI-IEL中調(diào)節(jié)細(xì)胞亞群的抑制效應(yīng)，包括γδ T細(xì)胞。TGF-β1最可能介導(dǎo)這一抑制效應(yīng)。