重組人CYP2C9，CYP2C19及其相關(guān)SNP酵母表達(dá)體系的構(gòu)建和其在藥物抑制篩選中的初步研究.pdf

1、CYP2C9，CYP2C19作為細(xì)胞色素P450家族的重要組成部分，在藥物代謝過程中擔(dān)任重要作用，據(jù)統(tǒng)計大約有20％臨床用藥被CYP2C家族代謝，但由于二者都是多態(tài)性顯著的酶，在臨床用藥時往往會引發(fā)一系列藥物不良反應(yīng)和藥物相互作用，因此對其基因多態(tài)性的研究就顯得頗為重要。 本研究采用體外重組技術(shù)，克隆、表達(dá)了CYP2C9，CYP2C19野生株及其相應(yīng)的5個SNPs(CYP2C9—R144C，CYP2C9-1359L，CYP2C1

2、9—S51G，CYP2C19—R329H，CYP2C19—R442C)，建立了一個體外表達(dá)重組CYP2C9，CYP2C19酶的酵母體系，并且利用這個體系表達(dá)的多態(tài)性酶對其進(jìn)行酶學(xué)分析和藥物抑制高通量實(shí)驗(yàn)，測得Km，Vmax，Clint以及半數(shù)抑制常數(shù)IC50，從而藥物相互作用的預(yù)測和新藥的研究開發(fā)提供了理論依據(jù)。 1.通過定點(diǎn)突變PCR的方法，在野生株的cDNA上引入突變位點(diǎn)，并將其與酵母表達(dá)載體pYES2/CT連接，經(jīng)測序驗(yàn)證

3、，電轉(zhuǎn)入已經(jīng)整合了細(xì)胞色素P450氧化還原酶基因(POR)的釀酒酵母細(xì)胞，利用半乳糖誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，經(jīng)western blot驗(yàn)證，目的蛋白在55KD處有清晰的條帶出現(xiàn)，與預(yù)期大小相同，說明目的蛋白能夠表達(dá)。隨后大量誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白并使用bead beater裂解器裂解得酵母微粒體，經(jīng)BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出制備的微粒體濃度后，通過CO還原示差光譜法檢測，計算微粒體蛋白中P450的含量，結(jié)果如下： CYP2C9—WT30 pmol/mg

4、，CYP2C9—R144C60pmol/mg，CYP2C9—B59L8 pmol/mg，CYP2C19—WT30pmol/mg，CYP2C19—R329H53pmol/mg，CYP2C19—R442C27pmol/mg，CYP2C19—S51G未能計算出含量。 2.通過FDA公布的方法，使用探針底物通過HPLC驗(yàn)證體系的可行性，得到的Km值與FDA公布的數(shù)值比較，結(jié)果符合FDA的要求，并且與其他文獻(xiàn)報道的使用相同體系獲得的數(shù)據(jù)接

5、近；另外，對制備的酵母微粒體的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了考察，以保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度，包括制備的酶活性與人肝微粒體的比較，制備的酶的穩(wěn)定性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)制備的酶穩(wěn)定性可以滿足實(shí)驗(yàn)所需，在冰浴中可以保存6小時，且反復(fù)凍融不影響其活性，但經(jīng)過與人肝微粒體活性比較，發(fā)現(xiàn)其活性略低，但結(jié)果在本實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚪邮艿姆秶畠?nèi)，也證明了酵母表達(dá)體系的可靠性以及所得數(shù)據(jù)的真實(shí)性。 3.利用制備的酵母微粒體，進(jìn)行相應(yīng)的酶學(xué)分析。(1)分別使用探針底物與熒光底物對位點(diǎn)突

6、變引起的酶活性變化進(jìn)行檢測，(CYP2C9探針底物雙氯氛酸，熒光底物BOMCC；CYP2C19探針底物S—美芬妥英，熒光底物CEC)結(jié)果顯示，各位點(diǎn)的突變都不同程度的降低了CYP酶的活性，且CYP2C9-1359L和CYP2C19—R442C突變針對熒光底物和探針底物降低的程度不等。(2)同樣使用探針底物和熒光底物對制備的酵母微粒體進(jìn)行酶動力學(xué)研究，檢測各個突變株的Km，Vmax以及Clint，結(jié)果顯示：不論針對探針底物還是熒光底物，各

7、個突變株的Km均增大，Clint均下降，而Vmax變化差異較大。在探針底物實(shí)驗(yàn)中，與CYP2C9野生型相比，其突變株R144C和，I359L的Km分別增加了大約一倍和三倍，Clint分別為變化不大和下降了75％左右；與CYP2C19野生型相比，其突變株R329H，R442C的Km分別增加了三倍和略有增加，Clint分別下降了80％和95％，在熒光底物實(shí)驗(yàn)中，CYP2C9—R144C的Km比野生型增加了一倍，Clint下降了25％左右，C

8、YP2C19—S51G，R329H，R442C與野生型相比，Km都增大了一倍左右，Clint分別下降了30％，60％和30％。(3)利用熒光底物對8類22種藥物進(jìn)行高通量抑制實(shí)驗(yàn)，底物選取Km附近的濃度，藥物作為抑制劑稀釋成一系列的濃度，利用熒光檢測技術(shù)測定抑制劑的半數(shù)抑制常數(shù)IC50，其中也包括CYP2C9和CYP2C19已知的特異性抑制劑，結(jié)果表明：CYP2C9特異性抑制劑磺胺苯比唑的IC50為0.7，CYP2C19特異性抑制劑反苯

9、環(huán)并胺IC50值為7.1，均與FDA公布的數(shù)值接近，也說明了該方法的可行性。其他抑制劑對制備的微粒體的抑制程度各不相同，化學(xué)結(jié)構(gòu)或治療作用類似的同類藥品對CYP2C9，CYP2C19的抑制情況不一；不同基因型被同一種藥物抑制程度也不盡相同，甚至差別較大。 本實(shí)驗(yàn)成功地建立了重組人CYP2C9，CYP2C19及其相應(yīng)SNP的酵母表達(dá)系統(tǒng)，初步建立了對CYP2C9，CYP2C19多態(tài)性重組酶進(jìn)行酶動力學(xué)檢測和藥物抑制作用的體外檢測技