人CYP2D6多態(tài)性酶的體外表達及其在藥物篩選中的應(yīng)用.pdf

1、CYP2D6是P450家族中一種極為重要的藥物代謝酶，參與多種藥物的代謝；同時，又是一種極具多態(tài)性的酶，含有70多種等位基因，上百個SNP位點，代謝藥物時表現(xiàn)出明顯的個體差異；而且通過與之作用，藥物與藥物之間常常發(fā)生相互作用而引起藥物不良反應(yīng)。為了研究CYP2D6 SNP酶的活性差異和藥物對不同SNP酶的作用差異，我們通過單位點突變技術(shù)得到了G169R，P34S，E410K，V7M，Q151E 5個SNP株，并使其在釀酒酵母中表達，制備

2、蛋白微粒體，再分別用2D6的探針底物丁夫洛爾和特異性抑制劑奎尼丁對各酶進行了鑒定。最后，在2D6的熒光底物AMMC下，對藥物進行抑制性篩選，求出各藥的IC50值，分析不同的藥對不同的SNP酶的抑制作用差異。結(jié)果如下： 1.CYP2D6 WT和5個SNP克隆與表達 DNA測序結(jié)果表明，通過PCR定點突變技術(shù)得到的5個SNP株G169R，P34S，E410K，V7M，Q151E成功引入了突變堿基；通過Western Blot

3、證實，重組的WT和5個SNP酶在釀酒酵母中成功得到了表達；用CO-還原示差光譜法對各酶的含量測定時發(fā)現(xiàn)，只有CYP2D6-WT、V7M在450mm處有吸收峰，含量分別為：16.5pmol/mg、101.6pmol/mg。 2.CYP2D6 WT和5個SNP重組酶活性的測定用底物丁夫洛爾和AMMC測得的CYP2D6 Wt的Km、Vmax、Vmax/Km值分別為19.8μM、175.4 pmol/min/mg、8.9μl/min/m

4、g；2.39μmol/L、22.8pmol/min/mg、9.8μL/min/mg。與WT相比較，V7M活性均要高，G169R、E410K和Q151E均稍低，P34S活性都要低很多。 3.特異性抑制奎尼丁能強烈的抑制CYP2D6 WT和5個SNP的活性，半數(shù)抑制常數(shù)IC50值均不大于0.1μmol/L。 4.藥物對CYP2D6 WT的抑制在探針底物丁夫洛爾和熒光底物AMMC下，23種藥對CYP2D6 WT進行抑制實驗求得

5、各藥的IC50值，比較發(fā)現(xiàn)，在兩種底物下，大部分藥物的IC50值都相差不大。把IC50值分別進行取對數(shù)后作圖，得到二者的相關(guān)系數(shù)R2=0.75。 5.不同藥物對不同SNP酶的抑制藥物對WT、SNPl和SNP2的抑制程度排序均為：氯丙嗪>氟西汀>阿米替林>舍曲林>酮康唑(=曲格列酮)；同一種藥對不同酶的半數(shù)抑制常數(shù)表現(xiàn)出不同程度的差異。 總之，本實驗采用釀酒酵母表達系統(tǒng)成功表達了具有催化活性的CYP2D6WT及5個SNP酶