重組人CYP2D6基因的克隆表達及其應(yīng)用于藥物篩選研究的初探.pdf

1、人CYP2D6多態(tài)性的分子機制及其與藥物代謝的影響是近來研究的熱點，已發(fā)現(xiàn)的人CYP2D6變異體己超過70種。盡管國內(nèi)外相關(guān)報道較多，但多以等位基因為單位進行研究；且由于酶制備、探針底物、分析條件的不同，已公布的一些CYP2D6反應(yīng)表現(xiàn)型的數(shù)據(jù)非常雜亂，常有結(jié)果前后矛盾，使得結(jié)果的解釋非常困難。 本研究通過克隆及表達2D6野生株及有代表性的8個單核苷酸突變株cDNA(它們分別代表在人體內(nèi)天然存在的多態(tài)性等位基因，同時這些突變不包

2、括同義突變，在調(diào)控區(qū)的突變和引起蛋白缺失的突變)，對這些多態(tài)性等位基因進行酶動力學(xué)分析，并進一步對其進行藥物抑制高通量篩選，計算藥物對其的抑制常數(shù)，所得數(shù)據(jù)可為研究多態(tài)性等位基因在藥物代謝中的作用，及預(yù)測體內(nèi)藥物-藥物相互作用提供重要的數(shù)據(jù)和信息。 1.CYP2D6基因的克隆根據(jù)基因庫CYP2D6野生株的cDNA序列設(shè)計引物，通過RT-PCR擴增得到CYP2D6的野生株cDNA基因片段，并將其克隆到酵母表達載體pYES2/CT上

3、，構(gòu)建重組質(zhì)粒，進行DNA測序確認。通過定點突變方法獲得8個CYP2D6單點突變株cDNA基因片段，以同樣方法克隆到穿梭載體pYES2/CT上，該載體能夠在釀酒酵母中表達重組蛋白。 2.CYP2D6重組質(zhì)粒的表達將CYP2D6重組質(zhì)粒的野生株和8個突變株分別轉(zhuǎn)入到釀酒酵母細胞營養(yǎng)缺陷型INVSc1中，目的蛋白在半乳糖誘導(dǎo)下進行表達。隨后收獲細胞，玻璃珠研磨法破碎細胞壁，即得到含有CYP2D6重組酶的細胞破碎液。通過Western

4、-blot法檢測到帶有V5標簽的目的蛋白表達。 3.CYP2D6重組蛋白的大量誘導(dǎo)和表達產(chǎn)物分析以同樣誘導(dǎo)條件下大量誘導(dǎo)CYP2D6重組蛋白表達，超聲破碎酵母細胞壁。超速差速離心后，得到富含CYP2D6酶蛋白的酵母細胞微粒體。取少量用CO-差示光譜法進行P450含量測定。 4．CYP2D6重組酶的酶活性測定采用熒光多孔板技術(shù)，結(jié)合CYP2D6酶代謝探針底物AMMC時熒光生成量，進行9個CYP2D6重組酶活性測定。在NAD

5、PH再生系統(tǒng)溶液中加入富含CYP2D6酶蛋白的微粒體、一系列梯度濃度的探針底物AMMC進行孵育反應(yīng)。數(shù)據(jù)分析，得到各個重組酶的酶動力學(xué)參數(shù)--CYP2D6野生株和8個突變株的重組酶催化AMMC的Km值、Vmax值、內(nèi)在清除率Clint。檢測結(jié)果表明：與野生型CYP2D6的Km相比，V7M、V11M、P325L位點氨基酸殘基突變均對酶活力沒有明顯影響；P34S位點氨基酸殘基突變導(dǎo)致酶催化活力降低；G42R、G212E、L213S、L421

6、P氨基酸殘基的突變導(dǎo)致酶失活。 5.多種藥物抑制CYP2D6酶代謝活性的篩查以首選抑制劑奎寧丁測定其對CYP2D6酶代謝探針底物AMMC時抑制實驗效果。由此利用體外模型來研究多種藥物抑制CYP2D6酶代謝活性的檢測，囊括抗精神病藥，抗心律失常藥，抗抑郁藥，降血壓藥，抗炎鎮(zhèn)痛藥，抗真菌藥，抗酸藥，抗糖尿病藥，調(diào)節(jié)血脂及抗動脈硬化藥，抗凝血藥，防治心絞痛藥等11大類藥，初步研究總結(jié)不同種藥物對CYP2D6酶代謝活性的影響。并初步成功