大鼠腦S100B和GFAP的表達(dá)變化在原發(fā)性腦干損傷診斷中的作用研究.pdf

1、原發(fā)性腦干損傷(Primary brain stem injury,PBSI)通常是指暴力作用于頭部引起腦干為主的損傷,并于傷后立即發(fā)生持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的意識(shí)喪失乃至死亡。腦干損傷的類型包括腦干橫斷、挫裂、挫傷出血、彌散性軸索損傷(diffuse axonalinjury,DAI)和水腫等,腦干損傷的形態(tài)學(xué)改變與其機(jī)能障礙的不同步性是腦干損傷的最大特點(diǎn)和表現(xiàn)。往往在腦干的形態(tài)學(xué)改變并不明顯時(shí),機(jī)體已發(fā)生死亡。由于腦干損傷后死亡率較高、死亡者

2、傷后存活時(shí)間短,傷后癥狀和其它類型顱腦損傷存在交叉,一般影像學(xué)檢查以及死后常規(guī)病理學(xué)診斷常難以確定腦干是否存在損傷,使其在臨床醫(yī)學(xué)診斷以及法醫(yī)學(xué)診斷中存在很大的困難。目前對(duì)于顱腦損傷后迅速死亡者的法醫(yī)學(xué)鑒定仍然缺乏早期快速的診斷指標(biāo),因此,尋找確鑿的腦干損傷早期病變的依據(jù),成為確定是否腦干死的重要手段。
　　 大量研究表明,S100B對(duì)顱腦損傷有高度的敏感性及特異性。S100B屬于鈣結(jié)合蛋白,在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,主要由神經(jīng)

3、膠質(zhì)細(xì)胞合成和分泌,特別是星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞,具有腦特異性。當(dāng)顱腦損傷時(shí),由小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的IL-1強(qiáng)烈刺激星形細(xì)胞活化和增殖,產(chǎn)生大量的S100B。早在1965年McGecr等就證明,在體和離體實(shí)驗(yàn)中IL-1能顯著上調(diào)S100B蛋白水平,使其升高較正常3倍以上。此外,IL-6,TNF-α對(duì)S100B蛋白的表達(dá)亦有促進(jìn)作用。同時(shí),S100B蛋白自身也可促進(jìn)星形細(xì)胞的肥大、增殖,從而產(chǎn)生更多的S100B蛋白,形成正反饋調(diào)節(jié)。另外,

4、S100B在脫髓鞘病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(多發(fā)性硬化、格林-巴利綜合征)及Alzheimer病中亦出現(xiàn)高表達(dá)。但是,S100B蛋白在原發(fā)性腦干損傷中的基因及其蛋白表達(dá)情況,至今尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillory acidic protein,GFAP),是星形膠質(zhì)細(xì)胞的主要細(xì)胞骨架蛋白,也是特異性標(biāo)志蛋白,正常情況下,對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起支持及代謝作用。腦干損傷后,星形膠質(zhì)細(xì)胞即可發(fā)生增殖反應(yīng),出現(xiàn)明顯的功

5、能活躍,并于腦干損傷早期即有快速反應(yīng),是反應(yīng)腦干損傷的靈敏指標(biāo)之一。目前對(duì)其應(yīng)用于顱腦損傷以及腦干損傷國(guó)外已有報(bào)道,認(rèn)為其在診斷早期顱腦損傷診斷方面,是一個(gè)可靠的標(biāo)記物。但國(guó)內(nèi)對(duì)S100B蛋白在顱腦以及腦干損傷中的作用卻鮮有報(bào)道,特別是在腦干損傷中的作用,無(wú)人提及。因此,本研究致力于①調(diào)查S100B蛋白在腦干損傷早期診斷中的作用；②同步研究GFAP在原發(fā)性腦干損傷中的作用、與S100B蛋白表達(dá)的關(guān)系、及其與損傷時(shí)間的關(guān)系,為腦干損傷時(shí)間

6、的推斷提供參考依據(jù)。
　　 綜合現(xiàn)有文獻(xiàn),本研究在我們前期研究建立的腦干損傷動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上,采用常規(guī)病理染色法觀察腦干損傷形態(tài)學(xué)的改變,同時(shí)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫組織化學(xué)等技術(shù),觀察腦干損傷后S100B和GFAP的表達(dá)變化,以探索其在原發(fā)性腦干損傷診斷及時(shí)間推斷中的意義。
　　 按照課題設(shè)計(jì),本研究分為三部分。實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1.腦干損傷動(dòng)物模型的建立和病理形態(tài)學(xué)觀察
　　 自制動(dòng)

7、物模型裝置,主要有鐵支架、引導(dǎo)管、打擊物及木板組成。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為85只雄性SD大鼠,重量為180-220g,采用100g/L水合氯醛(300mg/Kg)腹腔注射麻醉大鼠,使大鼠俯臥于底座上；調(diào)整引導(dǎo)管對(duì)準(zhǔn)枕骨粗隆,并觀察呼吸和心率等生命體征的改變。讓打擊物從引導(dǎo)管的65cm處自由下滑打擊大鼠,作用力的大小表示為65cm/450g/45°,每只大鼠只打擊一次,其中5只大鼠即刻死亡未計(jì)入組內(nèi)。生前損傷組70只,其中30min內(nèi)死亡者10只,記

8、為腦干損傷死亡組；60只存活分別于傷后2h、6h、12h、24h、48h、72h處死,記為傷后存活組,每組10只；正常對(duì)照組lO只不進(jìn)行打擊直接處死。所有處死大鼠均取腦干組織。
　　 結(jié)果:所有實(shí)驗(yàn)組大鼠均可見(jiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血明顯,腦干組織水腫,腦干內(nèi)見(jiàn)散在的點(diǎn)片狀或橢圓形小片狀出血,傷后30min內(nèi)死亡者出血部位較為廣泛,數(shù)量多,傷后存活者,出血數(shù)量相對(duì)較少。Gless銀染發(fā)現(xiàn)對(duì)照組大鼠腦干組織軸索排列規(guī)整,走行一致,軸索間隙均

9、一。30min內(nèi)死亡的大鼠彌漫性分布的軸索腫脹、斷裂、扭曲呈蚯蚓狀,末端膨大,軸索間隙增寬。傷后2h、6h組在腦干見(jiàn)到上述軸索損傷變化更加明顯,以軸索斷裂、腫脹及扭曲為主。傷后12h可觀察到因軸索斷裂后軸漿流出到腦組織局部所形成的軸索收縮球,24h軸索收縮球數(shù)量增多,體積增大,至72h開(kāi)始減少。
　　 2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)腦干組織中S100B-mRNA表達(dá)變化
　　 實(shí)驗(yàn)對(duì)象從上述各組中隨機(jī)抽取,每組5只。嚴(yán)格按

10、照試劑盒的操作步驟進(jìn)行。
　　 結(jié)果:與對(duì)照組比較,30min內(nèi)死亡組大鼠腦干組織中S100B-mRNA沒(méi)有顯著性差異；傷后2h組腦干組織中S100B-mRNA顯著降低,之后隨時(shí)間的延長(zhǎng),表達(dá)逐漸升高,并于24h達(dá)到高峰,48h基本降至正常水平,72h表達(dá)與正常對(duì)照組亦無(wú)顯著差異。
　　 3.免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腦干組織中S100B和GFAP的改變
　　 正常對(duì)照組可見(jiàn)S100B陽(yáng)性染色均勻分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體

11、及突起中。30min死亡組和傷后存活組(2h、12h、24h、48h)可見(jiàn)大量陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá),傷后存活組(72h)腦干組織的表達(dá)與正常對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。正常對(duì)照組GFAP分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿及突起中。傷后30min死亡組GFAP表達(dá)增強(qiáng),有的細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則；隨時(shí)間的延長(zhǎng)陽(yáng)性表達(dá)逐步上升,至72h表達(dá)開(kāi)始下降。
　　 根據(jù)以上研究結(jié)果,我們得出以下結(jié)論:
　　 1.采用上述方法制作的腦干損傷動(dòng)物模型,是用外來(lái)機(jī)械作

12、用力直接作用于顱骨,能準(zhǔn)確的打擊大鼠枕骨粗隆,可以較好的模擬人體真實(shí)狀態(tài)下的顱腦損傷情況,且操作簡(jiǎn)單,易于評(píng)價(jià),可用于腦干損傷的發(fā)生機(jī)制、病理生理改變及損傷后果等方面的研究。
　　 2.原發(fā)性腦干損傷后S100B-mRNA即有快速的表達(dá),參與了神經(jīng)細(xì)胞對(duì)損傷的應(yīng)激反應(yīng),表達(dá)具有特異性,有時(shí)間規(guī)律,可以作為腦干損傷早期診斷的標(biāo)記物。
　　 3.原發(fā)性腦干損傷后S100B、GFAP的表達(dá)能夠反應(yīng)損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化,在損