S100B在膠質(zhì)瘤生長中的作用及其機制的研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是神經(jīng)外科中最常見的惡性腫瘤，它是神經(jīng)上皮性腫瘤，常由間質(zhì)細胞組成，其生長特點為浸潤性生長，常見的臨床癥狀為顱內(nèi)壓增高及相應生長部位的局灶性癥狀，該腫瘤的惡性程度高，與周圍組織界限不清，生長迅速且具有很強的侵襲性，目前為止仍無法手術完全切除，術后容易復發(fā)，且由于血腦屏障的存在致使化療的效果不佳。目前可用的治療方法有手術治療、放療、化療、免疫治療、基因治療、微波治療等綜合治療方法。膠質(zhì)瘤患者的預后非常差，中位生存期為18個月。

2、>　　S100B是鈣結合蛋白多基因家族中的一員，它在細胞的代謝、增殖和移動中發(fā)揮了一定作用。研究表明神經(jīng)系統(tǒng)中的星形細胞釋放出毫摩爾級別濃度的S100B蛋白至細胞外間隙，從而促進軸突的生長并能保護神經(jīng)元。在腫瘤、炎癥等病理條件下，S100B蛋白的濃度上升至微摩爾濃度級別，從而刺激小神經(jīng)膠質(zhì)細胞和星形細胞，并能升高前炎性細胞因子的表達。S100B蛋白在大部分惡性膠質(zhì)瘤中過度表達。目前常認為腫瘤的發(fā)生是因為腫瘤抑制蛋白p53的功能受到抑制以

3、及通過刺激有絲分裂激活酶Ndr和Akt來調(diào)節(jié)細胞增殖及分化。S100B蛋白的濃度與膠質(zhì)瘤的生長及星形細胞的功能有關系。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中S100B蛋白可能會有利于星形細胞的分化并可能促進星形細胞的活化和運動。但是，S100B在膠質(zhì)瘤發(fā)生中的所起的作用，以及S100B對該作用的機制，目前為止還沒有廣泛的研究，還是不清楚。
　　目的：
　　目前關于S100B蛋白在膠質(zhì)瘤發(fā)生、生長中的作用還沒有進行廣泛的研究。此前研究顯示即使低濃度的

4、S100B蛋白亦可激活Stat3從而調(diào)節(jié)腫瘤相關巨噬細胞(TAM)的活性。因此，我們假設:S100B蛋白的表達同樣可以通過調(diào)節(jié)體內(nèi)TAM的活性來促進膠質(zhì)瘤的生長增殖。
　　本實驗通過使用多種試驗手段觀察S100B蛋白在膠質(zhì)瘤生長方面的作用以及S100B在腫瘤生長及血管生成時起作用的途徑，從而明確S100B在膠質(zhì)瘤發(fā)生及生長中所起的作用，初步闡明S100B通過何種途徑促進膠質(zhì)瘤生長的機制，并探討在膠質(zhì)瘤治療方面以S100B蛋白為靶點

5、，使用S100B抑制劑來抑制腫瘤生長的潛在的利用價值。
　　方法：
　　1.穩(wěn)定轉染的三種細胞系:使用細胞轉染及篩選后穩(wěn)定表達并傳代的三種細胞系。
　　2.S100B對膠質(zhì)瘤生長的作用:
　　2.1S100B在體外試驗時對GL261細胞系生長的影響:使用Westernblot及其蛋白定量和ELISA檢測S100B在三種細胞系中的表達情況，用細胞計數(shù)法及流式細胞術檢測三種細胞系細胞在體外培養(yǎng)的生長速度。
　　

6、2.2S100B在膠質(zhì)瘤動物模型中對GL261細胞生長的影響:使用熒光免疫組織化學、實際腫瘤大小的比較、三種細胞系小鼠生存試驗、流式細胞術、活體動物血管成像來檢測S100B在動物模型中對腫瘤生長的影響。
　　2.3抑制S100B對膠質(zhì)瘤動物模型中GL261細胞生長的影響:使用Westernblot、小鼠生存試驗、流式細胞術、流式細胞術檢測S100B受抑制時對膠質(zhì)瘤生長的影響。
　　2.4S100B對炎癥及巨噬細胞浸潤情況的影

7、響:使用NF-κB檢測、RT-PCR及流式細胞術檢測S100B對炎癥及巨噬細胞浸潤情況的影響。
　　3.RAGE在膠質(zhì)瘤生長的影響:使用Westernblot、熒光免疫組織化學、RT-PCR、流式細胞術檢測RAGE在膠質(zhì)瘤生長中的作用。
　　4.CLL2在膠質(zhì)瘤生長中的影響:使用ELISA、Westernblot、熒光免疫組織化學、RT-PCR檢測CLL2在膠質(zhì)瘤生長中的影響。
　　5.S100B與膠質(zhì)瘤的聯(lián)系:使用惡

8、性腫瘤基因圖譜分析來檢測S100B與腫瘤亞型的關系及在各個亞型中S100B與CLL2的關聯(lián)性。
　　結果：
　　1.S100B可以促進體內(nèi)膠質(zhì)瘤的生長
　　我們發(fā)現(xiàn)三種不同S100B表達水平的GL261細胞系在體外生長的增值速率相似。與此相反，這三種細胞系在體內(nèi)腫瘤的生長速率及腫瘤血管生成速度是有區(qū)別的。
　　2.S100B促進了炎癥的發(fā)展并增強了巨噬細胞對膠質(zhì)瘤的滲透能力體內(nèi)S100B高表達的細胞系S100Bh

9、igh腫瘤表現(xiàn)出了增強的炎性反應，流式細胞術同時證明巨噬細胞（CD11bhighCD45high）在S100Bhigh和S100Bw(t)中的表達要高于在S100Blow中的表達，并發(fā)現(xiàn)通過抑制S100B可以減低TAM的浸潤并可以延長載膠質(zhì)瘤動物的生存期。
　　3.S100B誘導的RAGE活化
　　S100B在腫瘤中可以誘導RAGE活化，S100B是唯一一個在腫瘤中可以刺激RAGE表達的RAGE配體，但RAGE可能不是S10

10、0B介導的TAM浸潤模型中的必須品。
　　4.趨化因子的產(chǎn)生
　　體內(nèi)體外實驗表明S100B表達的上調(diào)導致了GL261細胞中CCL2的誘導的發(fā)生，并且它是TAM浸潤入膠質(zhì)瘤組織過程中的決定因素。相反的是，這三種細胞系分泌的CXCL12卻沒有明顯的區(qū)別。另外相關的一個細胞系也證實CCL2的表達隨S100B的增加而增加，并且同時增加的還有TAM的浸潤。
　　5.與人類膠質(zhì)瘤的關系
　　為了評價我們發(fā)現(xiàn)的結果與人類膠質(zhì)

11、瘤之間的聯(lián)系，通過分析TCGA中開放數(shù)據(jù)庫提供的數(shù)據(jù)，S100B的表達與原神經(jīng)性、神經(jīng)性、經(jīng)典型膠質(zhì)瘤有正相關關系，并發(fā)現(xiàn)S100B的表達在所有TCGAHTU133Aarray中與CCL2的表達有關系，并且在神經(jīng)元型及原神經(jīng)元型膠質(zhì)瘤亞型中有更強的關聯(lián)。以上結果肯定了S100B在一些膠質(zhì)瘤亞型中可能是通過上調(diào)CCL2的表達來進行TAM浸潤這一過程。
　　結論：
　　體內(nèi)、體外實驗證實:膠質(zhì)瘤中S100B很可能是通過CCL2的