S100B在膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)中的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是神經(jīng)外科中最常見的惡性腫瘤，它是神經(jīng)上皮性腫瘤，常由間質(zhì)細(xì)胞組成，其生長(zhǎng)特點(diǎn)為浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，常見的臨床癥狀為顱內(nèi)壓增高及相應(yīng)生長(zhǎng)部位的局灶性癥狀，該腫瘤的惡性程度高，與周圍組織界限不清，生長(zhǎng)迅速且具有很強(qiáng)的侵襲性，目前為止仍無法手術(shù)完全切除，術(shù)后容易復(fù)發(fā)，且由于血腦屏障的存在致使化療的效果不佳。目前可用的治療方法有手術(shù)治療、放療、化療、免疫治療、基因治療、微波治療等綜合治療方法。膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后非常差，中位生存期為18個(gè)月。

2、>　　S100B是鈣結(jié)合蛋白多基因家族中的一員，它在細(xì)胞的代謝、增殖和移動(dòng)中發(fā)揮了一定作用。研究表明神經(jīng)系統(tǒng)中的星形細(xì)胞釋放出毫摩爾級(jí)別濃度的S100B蛋白至細(xì)胞外間隙，從而促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)并能保護(hù)神經(jīng)元。在腫瘤、炎癥等病理?xiàng)l件下，S100B蛋白的濃度上升至微摩爾濃度級(jí)別，從而刺激小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞，并能升高前炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。S100B蛋白在大部分惡性膠質(zhì)瘤中過度表達(dá)。目前常認(rèn)為腫瘤的發(fā)生是因?yàn)槟[瘤抑制蛋白p53的功能受到抑制以

3、及通過刺激有絲分裂激活酶Ndr和Akt來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分化。S100B蛋白的濃度與膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)及星形細(xì)胞的功能有關(guān)系。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中S100B蛋白可能會(huì)有利于星形細(xì)胞的分化并可能促進(jìn)星形細(xì)胞的活化和運(yùn)動(dòng)。但是，S100B在膠質(zhì)瘤發(fā)生中的所起的作用，以及S100B對(duì)該作用的機(jī)制，目前為止還沒有廣泛的研究，還是不清楚。
　　目的：
　　目前關(guān)于S100B蛋白在膠質(zhì)瘤發(fā)生、生長(zhǎng)中的作用還沒有進(jìn)行廣泛的研究。此前研究顯示即使低濃度的

4、S100B蛋白亦可激活Stat3從而調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)的活性。因此，我們假設(shè):S100B蛋白的表達(dá)同樣可以通過調(diào)節(jié)體內(nèi)TAM的活性來促進(jìn)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)增殖。
　　本實(shí)驗(yàn)通過使用多種試驗(yàn)手段觀察S100B蛋白在膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)方面的作用以及S100B在腫瘤生長(zhǎng)及血管生成時(shí)起作用的途徑，從而明確S100B在膠質(zhì)瘤發(fā)生及生長(zhǎng)中所起的作用，初步闡明S100B通過何種途徑促進(jìn)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的機(jī)制，并探討在膠質(zhì)瘤治療方面以S100B蛋白為靶點(diǎn)

5、，使用S100B抑制劑來抑制腫瘤生長(zhǎng)的潛在的利用價(jià)值。
　　方法：
　　1.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的三種細(xì)胞系:使用細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選后穩(wěn)定表達(dá)并傳代的三種細(xì)胞系。
　　2.S100B對(duì)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的作用:
　　2.1S100B在體外試驗(yàn)時(shí)對(duì)GL261細(xì)胞系生長(zhǎng)的影響:使用Westernblot及其蛋白定量和ELISA檢測(cè)S100B在三種細(xì)胞系中的表達(dá)情況，用細(xì)胞計(jì)數(shù)法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三種細(xì)胞系細(xì)胞在體外培養(yǎng)的生長(zhǎng)速度。
　　

6、2.2S100B在膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型中對(duì)GL261細(xì)胞生長(zhǎng)的影響:使用熒光免疫組織化學(xué)、實(shí)際腫瘤大小的比較、三種細(xì)胞系小鼠生存試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、活體動(dòng)物血管成像來檢測(cè)S100B在動(dòng)物模型中對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。
　　2.3抑制S100B對(duì)膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型中GL261細(xì)胞生長(zhǎng)的影響:使用Westernblot、小鼠生存試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)S100B受抑制時(shí)對(duì)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的影響。
　　2.4S100B對(duì)炎癥及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況的影

7、響:使用NF-κB檢測(cè)、RT-PCR及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)S100B對(duì)炎癥及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況的影響。
　　3.RAGE在膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的影響:使用Westernblot、熒光免疫組織化學(xué)、RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RAGE在膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)中的作用。
　　4.CLL2在膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)中的影響:使用ELISA、Westernblot、熒光免疫組織化學(xué)、RT-PCR檢測(cè)CLL2在膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)中的影響。
　　5.S100B與膠質(zhì)瘤的聯(lián)系:使用惡

8、性腫瘤基因圖譜分析來檢測(cè)S100B與腫瘤亞型的關(guān)系及在各個(gè)亞型中S100B與CLL2的關(guān)聯(lián)性。
　　結(jié)果：
　　1.S100B可以促進(jìn)體內(nèi)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)
　　我們發(fā)現(xiàn)三種不同S100B表達(dá)水平的GL261細(xì)胞系在體外生長(zhǎng)的增值速率相似。與此相反，這三種細(xì)胞系在體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)速率及腫瘤血管生成速度是有區(qū)別的。
　　2.S100B促進(jìn)了炎癥的發(fā)展并增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤的滲透能力體內(nèi)S100B高表達(dá)的細(xì)胞系S100Bh

9、igh腫瘤表現(xiàn)出了增強(qiáng)的炎性反應(yīng)，流式細(xì)胞術(shù)同時(shí)證明巨噬細(xì)胞（CD11bhighCD45high）在S100Bhigh和S100Bw(t)中的表達(dá)要高于在S100Blow中的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)通過抑制S100B可以減低TAM的浸潤(rùn)并可以延長(zhǎng)載膠質(zhì)瘤動(dòng)物的生存期。
　　3.S100B誘導(dǎo)的RAGE活化
　　S100B在腫瘤中可以誘導(dǎo)RAGE活化，S100B是唯一一個(gè)在腫瘤中可以刺激RAGE表達(dá)的RAGE配體，但RAGE可能不是S10

10、0B介導(dǎo)的TAM浸潤(rùn)模型中的必須品。
　　4.趨化因子的產(chǎn)生
　　體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)表明S100B表達(dá)的上調(diào)導(dǎo)致了GL261細(xì)胞中CCL2的誘導(dǎo)的發(fā)生，并且它是TAM浸潤(rùn)入膠質(zhì)瘤組織過程中的決定因素。相反的是，這三種細(xì)胞系分泌的CXCL12卻沒有明顯的區(qū)別。另外相關(guān)的一個(gè)細(xì)胞系也證實(shí)CCL2的表達(dá)隨S100B的增加而增加，并且同時(shí)增加的還有TAM的浸潤(rùn)。
　　5.與人類膠質(zhì)瘤的關(guān)系
　　為了評(píng)價(jià)我們發(fā)現(xiàn)的結(jié)果與人類膠質(zhì)

11、瘤之間的聯(lián)系，通過分析TCGA中開放數(shù)據(jù)庫提供的數(shù)據(jù)，S100B的表達(dá)與原神經(jīng)性、神經(jīng)性、經(jīng)典型膠質(zhì)瘤有正相關(guān)關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)S100B的表達(dá)在所有TCGAHTU133Aarray中與CCL2的表達(dá)有關(guān)系，并且在神經(jīng)元型及原神經(jīng)元型膠質(zhì)瘤亞型中有更強(qiáng)的關(guān)聯(lián)。以上結(jié)果肯定了S100B在一些膠質(zhì)瘤亞型中可能是通過上調(diào)CCL2的表達(dá)來進(jìn)行TAM浸潤(rùn)這一過程。
　　結(jié)論：
　　體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證實(shí):膠質(zhì)瘤中S100B很可能是通過CCL2的