BDNF及S100B蛋白在癲癇患兒的表達(dá)及其意義.pdf

1、癲癇是兒科常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。據(jù)國內(nèi)多次大樣本調(diào)查，我國癲癇的年發(fā)病率約為35/10萬人口，累計(jì)患病率約為3.5‰～4.8‰。近年來隨著抗癲癇藥物的不斷發(fā)展，多數(shù)患兒經(jīng)過正規(guī)用藥能較好地控制發(fā)作，但仍有20％～30％的患兒發(fā)展為難治性癲癇。長期、頻繁或嚴(yán)重的發(fā)作給患兒身心健康和其家庭帶來嚴(yán)重的影響，而癲癇的發(fā)病機(jī)理至今仍然不是十分明確。 關(guān)于癲癇的發(fā)病機(jī)理目前有多種假說。自1969年Walker首先提出免疫機(jī)制可能參與癲癇的發(fā)病

2、機(jī)制以來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)癲癇的免疫學(xué)改變作了大量的研究。目前認(rèn)為通過免疫學(xué)機(jī)制發(fā)生癲癇主要有兩種途徑：一是通過局部免疫反應(yīng)在腦內(nèi)產(chǎn)生一個(gè)具有致癇作用的慢性炎癥病灶；另一種是機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生了針對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞膜的抗體，從而破壞神經(jīng)元的穩(wěn)定性，產(chǎn)生無明顯病理損害的興奮性癲癇灶。免疫機(jī)制最終通過細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)而實(shí)現(xiàn)。近年來，對(duì)細(xì)胞因子的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)間平衡的改變與神經(jīng)元的興奮性及神經(jīng)傳導(dǎo)有著密切的聯(lián)系，一方面與驚厥有關(guān)的神經(jīng)元調(diào)亡，反應(yīng)性

3、膠質(zhì)細(xì)胞增生，軸突再生等過程受細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)；另一方面神經(jīng)元的興奮性活動(dòng)及損傷均可改變細(xì)胞因子的表達(dá)。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophicfactorBDNF)及EF手型鈣結(jié)合蛋白S100B蛋白作為神經(jīng)系統(tǒng)重要的細(xì)胞因子，是目前國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。 BDNF的生理作用非常復(fù)雜。有研究表明，BDNF可以保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)抗代謝性和興奮性氨基酸毒性損傷，防止細(xì)胞外Ca2+入胞和細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，

4、從而維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+的水平，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境；它可以抵抗一氧化氮(NO)介導(dǎo)的谷氨酸細(xì)胞毒性，保護(hù)神經(jīng)元免受損傷；可以調(diào)節(jié)自由基代謝，增加超氧化物岐化酶和谷光甘肽過氧化物酶等在神經(jīng)元內(nèi)的含量，減少自由基積聚，保護(hù)神經(jīng)元免受自由基的攻擊；能促進(jìn)神經(jīng)元的生存、分化、發(fā)育以及神經(jīng)突起生長和分枝，促進(jìn)神經(jīng)元損傷后的修復(fù)和再生，對(duì)神經(jīng)組織損傷、突觸傳遞和認(rèn)知功能均有保護(hù)作用。 許多證據(jù)證明癲癇病理生理機(jī)制與BDNF有關(guān)：癲癇模型的大腦中常

5、見局灶性神經(jīng)細(xì)胞死亡，及軸突、樹突、突觸的改變，以及神經(jīng)細(xì)胞的重塑現(xiàn)象，而BDNF是調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞生長、形態(tài)、存活及正常死亡的重要因子；神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為在神經(jīng)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)中起重要作用，而BDNF的受體TrkB是星形膠質(zhì)細(xì)胞起調(diào)節(jié)作用的重要環(huán)節(jié)；BDNF能提高興奮性神經(jīng)突觸傳遞作并減少抑制性神經(jīng)遞質(zhì)在激活的突觸中的抑制作用，從而有助于癇樣放電在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的傳遞；顳葉癲癇病人的海馬組織的顆粒細(xì)胞中，BDNFmRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)；伴有谷氨

6、酸釋放和鈣內(nèi)流的各種對(duì)腦的傷害性刺激如腦缺血、驚厥發(fā)作、低血糖昏迷等均可導(dǎo)致海馬和皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)BDNFmRNA表達(dá)顯著增高；BDNF高表達(dá)小鼠模型沒有大體的缺陷和行為異常，但表現(xiàn)為紅藻氨酸誘導(dǎo)的驚厥活動(dòng)增強(qiáng)；剔除BDNF受體TrkB的小鼠模型與正常小鼠相比，重復(fù)的電休克下不容易發(fā)展為癲癇。 基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們有理由認(rèn)為BDNF與癲癇有著密切的關(guān)系。BDNF雖然在生理情況下對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有營養(yǎng)及支持作用，但過度表達(dá)的BDNF卻恰好

7、相反，能明顯地增加神經(jīng)細(xì)胞的興奮性，增加驚厥的易感性，從而對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生有害的作用。BDNF如同一把雙刃劍，適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)起營養(yǎng)及保護(hù)作用，而過度的表達(dá)則表現(xiàn)為對(duì)腦神經(jīng)的興奮毒性。 PanW等研究顯示，靜脈注射BDNF能在血液中維持穩(wěn)定的濃度達(dá)60分鐘，并在早期出現(xiàn)快速的向腦擴(kuò)散，10分鐘后進(jìn)入腦皮質(zhì)的BDNF主要分布在腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞而不是上皮細(xì)胞，說明外周血循環(huán)中示經(jīng)修飾的BDNF能完整地通過血腦屏障，該研究還顯示，腦室內(nèi)注

8、射BDNF后，BDNF從腦向血液擴(kuò)散的速率與腦從血液中重吸收BDNF的速率近似[24]。以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為我們測定血漿中的BDNF濃度來評(píng)估癲癇患兒大腦的興奮性提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 S100B蛋白是一種手形鈣離子傳感器蛋白，也是目前研究比較廣泛的與神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)的細(xì)胞因子。它可直接抑制靶蛋白的磷酸化；能激活腦果糖1，6二磷酸醛縮酶和葡萄糖磷酸變位酶，調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量代謝；在鈣離子存在的情況下，能激活一種位于細(xì)胞核內(nèi)的，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞分

9、化和形態(tài)的絲氨酸/酪氨酸蛋白激酶Ndr；還能作用于光感受器外膜上的鳥苷酸環(huán)化酶，并能通過與微管、微絲等細(xì)胞骨架成分直接或間接的相互作用以調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)；因此，生理?xiàng)l件下，S100B蛋白對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有廣泛而重要的生物活性。由于S100B蛋白主要(96％)存在于腦組織中，因而被認(rèn)為是腦特異性蛋白。 另有研究發(fā)現(xiàn)，Alzheimer病等神經(jīng)退行性病變病人腦中以及精神分裂癥患者、腦癱患兒血清中均有較高水平S100B蛋白的表達(dá)。2004年

10、WainwrightM.S等研究發(fā)現(xiàn)，過度表達(dá)S100B蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠，比野生型及S100B裸基因小鼠更容易受圍產(chǎn)期缺氧損傷，其死亡率及腦神經(jīng)病理損傷以及由缺氧引起的腦容積丟失均顯著地高于后二者。在體外實(shí)驗(yàn)中S100B還可誘導(dǎo)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡。以上證據(jù)說明，腦組織中過度表達(dá)的S100B蛋白對(duì)神經(jīng)組織有毒性作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn)，腦損傷后，腦脊液和血清中S100B蛋白含量升高，升高程度與腦損傷程度以及預(yù)后有一定的關(guān)系，因而

11、S100B蛋白有望成為評(píng)估腦損傷程度和判斷疾病預(yù)后的新指標(biāo)。 1.研究目的和內(nèi)容本研究擬通過測定癲癇患兒以及正常對(duì)照兒童血漿中的BDNF及S100B蛋白的濃度，分析比較疾病不同階段、不同發(fā)作類型、不同抽搐持續(xù)時(shí)間、治療前后、不同治療效果的癲癇患兒以及正常對(duì)照兒童血漿中的BDNF及S100B蛋白的濃度變化，分析BDNF及S100B蛋白在不同癲癇兒童的表達(dá)規(guī)律及意義，為進(jìn)一步深入對(duì)癲癇的認(rèn)識(shí)，完善抗癲癇的治療方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

12、 2.材料和方法2.1分組將診斷明確的癲癇患兒按治療與否及治療效果分為三組：未治療組、抗癲癇藥物控制良好組以及抗癲癇藥物控制不佳組，并設(shè)正常兒童為對(duì)照組。 2.2實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的留取未治療組患兒及控制不佳組患兒均于抽搐后24小時(shí)內(nèi)抽血，控制良好組患兒及正常對(duì)照兒童于9AM之前空腹抽血，各抽取枸椽酸抗凝靜脈血2ml。本研究中有7例患兒做了腦脊液檢查，均在抽搐后24小時(shí)內(nèi)腰穿，留末段腦脊液約1.5ml。所抽取標(biāo)本均立即置高速離心儀離心(

13、1000轉(zhuǎn)/秒)10分鐘后，留上清液1ml，置一20℃冰箱待測。 2.3實(shí)驗(yàn)方法用ELISA法分別測定三組患兒及正常對(duì)照兒童血漿中BDNF及S100B蛋白的濃度，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。試劑盒分別采用美國RayBioteck公司的Human-BDNF-ELISA試劑盒及捷克斯洛伐克BioVendor公司的Human-S100B-ELISA試劑盒。實(shí)驗(yàn)操作過程嚴(yán)格按照說明書指示。 2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)

14、據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析及相關(guān)分析。 3.結(jié)果3.1癲癇組患兒血漿BDNF及S100B蛋白濃度均明顯高于正常對(duì)照組(p＜0.01)；二者間無顯著相關(guān)性(p＞0.05)； 3.2癲癇患兒腦脊液中BDNF及S100B蛋白濃度均明顯高于其血漿中濃度(p＜0.05)，二者呈明顯的正性相關(guān)，BDNF相關(guān)系數(shù)為0.811(p＜0.05)，S100B相關(guān)系數(shù)為0.799(p＜0.05)； 3.3癲癇患兒三個(gè)組別間BDNF濃度無顯

15、著差異(p＞0.05)； 3.4控制不佳組患兒血漿中S100B蛋白的濃度明顯低于未治療組患兒(p＜0.01)及控制良好組患兒(p＜0.05)，并與正常對(duì)照組無顯著差異(p＞0.05)；未治療組與控制良好組患兒血漿中S100B蛋白的濃度無顯著差異(p＞0.05)； 3.5不同藥物治療的癲癇患兒血漿BDNF及S100B蛋白濃度均無顯著差異(p＞0.05)； 3.6抽搐持續(xù)時(shí)間大于5分鐘的患兒血漿BDNF與S100B蛋

16、白濃度均顯著高于抽搐持續(xù)時(shí)間小于5分鐘的患兒(BDNF：p＜0.05；S100B：p＜0.01) 3.7控制不佳組血漿BDNF與S100B蛋白濃度之間呈正性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.626，(p＜0.05) 3.8全身性發(fā)作與部分性發(fā)作的癲癇患兒血漿BDNF濃度無顯著性差異(p＞0.05)，但全身性發(fā)作患兒血漿S100B蛋白濃度顯著高于部分性發(fā)作患兒(p＜0.05)。 4.結(jié)論4.1BDNF及S100B蛋白主要集中在中

17、樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，并能通過癲癇患兒的血腦屏障到達(dá)外周血液。血漿中高水平表達(dá)的BDNF可作為神經(jīng)細(xì)胞興奮性升高的指標(biāo)。血漿中的S100B蛋白可作為評(píng)估癲癇患兒腦組織損傷的特異性指標(biāo)。 4.2癲癇患兒體內(nèi)均存在過度表達(dá)的BDNF，過度表達(dá)的BDNF可能參與了癲癇的發(fā)生及發(fā)展過程。不同發(fā)作類型、不同治療時(shí)期，不同治效果的癲癇患兒，體內(nèi)BDNF的表達(dá)無顯著差異。 4.3血漿中BDNF濃度越高，大腦神經(jīng)興奮性越高，抽搐持續(xù)時(shí)間越長，