Otos基因對順鉑損傷大鼠耳蝸螺旋韌帶成纖維細胞的保護作用及機制研究.pdf

1、背景與目的： 順鉑是一類廣泛應用于臨床腫瘤治療的細胞毒性藥物，其腎毒性和耳毒性副作用嚴重影響患者生活質(zhì)量，隨著腫瘤耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)，順鉑的化療用量逐漸加大，毒副作用也愈加明顯，由于化療前水化和利尿劑的使用，腎毒性副作用已得到有效預防，因而對其耳毒性的防治成為一項亟待解決的課題。國內(nèi)外嘗試用藥物保護受損的內(nèi)耳細胞，但由于血迷路屏障的存在，藥物到達內(nèi)耳的有效濃度不高，療效受限，新的防治方法亟待探索。隨著分子生物學的發(fā)展，通過將特異性基

2、因轉入內(nèi)耳細胞中持久表達以拮抗順鉑的毒性作用，取得較好效果，基因治療已成為目前研究的熱點。 位于耳蝸外側壁的螺旋韌帶因為由間質(zhì)細胞構成一直未受到重視，近年研究發(fā)現(xiàn)，螺旋韌帶參與構成血迷路屏障，是內(nèi)耳鉀離子循環(huán)的樞紐，表達多種基因，如Cx26，Cx30，Cx31，Cx43，COCH以及Pendrin等，這些基因的異?？梢詫е侣犃p失，因此螺旋韌帶的功能在耳科學研究中逐步成為熱點。Otos是一種新發(fā)現(xiàn)的特異性表達于螺旋韌帶成纖維細胞

3、(SpiralLigament:Fibrocytes，SLFs)上的特殊基因，它的表達缺失可以導致耳聾，推測它可能具有保護螺旋韌帶成纖維細胞和維護耳蝸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用。但Otos在順鉑耳毒性病理過程中的作用和機制尚不清楚，本研究擬通過上調(diào)SLFs的Otos表達，探測Otos對SLFs順鉑損傷的保護作用及相關機制。 研究方法: 1、原位雜交法檢測大鼠耳蝸OtosmRNA的表達。 2、大鼠SLFs的原代培養(yǎng)和SLFs

4、類型的免疫熒光鑒定。 3、設計和構建表達大鼠Otos的腺病毒表達載體。應用RT-PCR技術由體外培養(yǎng)的大鼠SLFs總RNA中克隆出Otos基因，將Otos基因定向克隆到穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV上，經(jīng)與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸埃希菌BJ5183內(nèi)同源重組后，轉染293細胞進行包裝，并反復感染293細胞進行擴增，對其進行滴度及活性等檢測。 4、用構建好的腺病毒載體轉染培養(yǎng)的SLFs，確定其最佳感染復數(shù)(

5、Multiplicityofinfection，MOI)和感染時間。 5、用腺病毒載體的最佳感染復數(shù)和感染時間感染SLFs后，將細胞分兩大組，每組含3種細胞，即SLFs-AdOtos(含GFP)、SLFs-AdGFP和SLFs-nontransfection,兩個大組分別用20μM順鉑或DMEM作用12h后，用MTT和TUNEL法分別檢測細胞活力和凋亡情況，用RT-PCR檢測OtosmRNA的表達，免疫印跡檢測JNK、p-JNK

6、、ERK、p-ERK、p38、p-p38、bcl-2、bax、caspase-3蛋白的表達。 6、將Ad-Otos轉染的SLFs分5組，其中3組分別用JNK抑制劑SP600125、ERK抑制劑PD98059、p38抑制劑SB203580預處理后，用20μM順鉑作用細胞，另2組分別用20μM順鉑或DMEM處理作為對照，MTT和TUNEL法分別檢測細胞活力和凋亡情況，免疫印跡檢測bcl-2、bax和caspase-3的蛋白表達。

7、 結果： 1、原位雜交法顯示大鼠耳蝸螺旋韌帶上有OtosmRNA的表達。 2、成功培養(yǎng)并純化大鼠SLFs，免疫熒光鑒定為I型SLFs。 3、成功構建腺病毒表達載體Ad-Otos，經(jīng)過293細胞大量擴增，獲得病毒滴度約7x109pfu/ml。 4、經(jīng)過用Ad-Otos轉染培養(yǎng)的SLFs后，測得最適MOI為50。 5、單純轉染Ad-Otos后的SLFs，其細胞活力和凋亡無明顯變化，對MAPKs和線

8、粒體凋亡途徑無明顯影響。 6、順鉑損傷后，和對照細胞相比，轉染Ad-Otos的SLFs活力增加，凋亡減少，伴有JNK途徑的抑制、ERK途徑的活化和線粒體凋亡途徑的抑制。 7、應用信號途徑抑制劑，提示Otos對細胞的保護過程可能通過抑制JNK并活化ERK而實現(xiàn)；線粒體凋亡途徑可能受MAPKs信號通路調(diào)節(jié)。 結論：上調(diào)Otos基因的表達對順鉑損傷的SLFs可能具有保護作用，其機制可能通過抑制JNK、活化ERK及抑制線