microRNA-217對人皮膚成纖維細胞衰老的作用及機制研究.pdf

1、生物體衰老是一個包含不同器官和系統(tǒng)的、發(fā)生一系列特定變化的復雜過程。皮膚衰老是機體衰老最直接的表現(xiàn)，本質(zhì)和基礎是皮膚細胞的衰老，其不僅受控于遺傳基因的調(diào)節(jié)，也受控于表觀遺傳的調(diào)控，后者是衰老發(fā)生的重要機制，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑及microRNA(miRNA)調(diào)控等。
　　miRNA-217是一種已知高表達于人臍靜脈內(nèi)皮細胞及人冠狀動脈內(nèi)皮細胞中的miRNA，已被證實其在胰腺導管腺癌中能通過靶向調(diào)控KRAS起到腫

2、瘤抑制因子的作用，還可靶向調(diào)節(jié)Runx2，從而影響成骨細胞成熟。在衰老機制的研究中，已有報道顯示，miR-217在衰老的血管內(nèi)皮細胞中表達上調(diào)，并可通過抑制長壽基因Sirt1的表達導致血管內(nèi)皮細胞的衰老。然而，至目前為止，miR-217對于皮膚衰老的作用研究還不清楚。本課題組前期通過miRNA芯片發(fā)現(xiàn)傳代衰老組與年青組人皮膚成纖維細胞(Human skin fibroblasts，HSF)比較，miR-217的表達量明顯增加。因此，我們

3、推測miR-217可能在HSF衰老中起到了重要作用。
　　本研究通過三個部分證實miR-217在HSF衰老中的作用機制。第一部分:檢測比較年青組與衰老組HSF中miR-217的表達。第二部分:研究miR-217在HSF衰老過程中的作用。通過在年青組HSF中過表達miR-217并檢測細胞衰老的表型及相關衰老蛋白的表達，以探討miR-217在細胞衰老中的作用。第三部分:研究miR-217調(diào)控HSF衰老的機制:(1)通過生物信息學預測，

4、發(fā)現(xiàn)miR-217可能直接靶向DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)，利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)證明兩者的直接靶向關系;(2)在HSF中，檢測miR-217對DNMT1表達量的調(diào)節(jié)，及其通過DNMT1對細胞衰老調(diào)節(jié)的機制。
　　通過以上研究揭示miR-217能夠通過下調(diào)DNMT1來促進HSF的衰老，為皮膚衰老的研究和治療領域提供新的方向。
　　第一部分年青組與衰老組人皮膚成纖維細胞中miR-217的表達
　　目的:檢測自然

5、衰老與傳代衰老HSF中miR-217的表達水平。
　　方法:收取少年組（＜10歲）、中年組（30～50歲）與老年組(＞60歲)的正常人避光部位皮膚，原代培養(yǎng)HSF，并將少年組HSF進行傳代（年青組:P3-5，衰老組:P20-25），采用Real-time PCR方法檢測miR-217的表達量。
　　結(jié)果:和少年組細胞比較，中年組、老年組HSF中的miR-217表達量明顯升高（中年組:P＜0.05，老年組:P＜0.01），其中

6、老年組較中年組細胞中miR-217的表達量也顯著升高(P＜0.01)。和年青組細胞比較，傳代衰老組細胞的miR-217的表達量亦明顯升高(P＜0.01)。
　　結(jié)論:自然衰老與傳代衰老的HSF中miR-217的表達明顯上升。
　　第二部分 miRNA-217對人皮膚成纖維細胞衰老的作用
　　目的:研究miR-217在HSF衰老過程中的作用。
　　方法:在年青組HSF中，通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hsa-miR-217的慢病毒和

7、陰性對照慢病毒，48小時后，采用Real-time PCR方法檢測miR-217的表達量，MTT法檢測HSF細胞增殖能力，衰老β-半乳糖苷酶染色法檢測HSF的衰老相關染色率，western blot法檢測衰老相關蛋白P53、P21、sirt1等的改變。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)染hsa-miR-217的慢病毒后，HSF中的miR-217表達量顯著上調(diào)(P＜0.01)，細胞增殖能力明顯下調(diào)(P＜0.05)，衰老β-半乳糖苷酶染色率明顯上升(P＜

8、0.01)，衰老相關蛋白P53、P21的表達量上升、sirt1表達量下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論:過表達miR-217可明顯促進HSF的衰老，miR-217在HSF的衰老過程中起到重要作用。
　　第三部分 miRNA-217直接調(diào)控HSF中DNMT1的表達及機制
　　目的:研究miR-217在HSF衰老過程中的調(diào)控機制。
　　方法:通過MICRORNA.ORG網(wǎng)站預測DNMT1是否為hsa-miR-217可能

9、的直接靶向基因，并構(gòu)建DNMT1的3'UTR區(qū)域的野生型與突變型的熒光素酶報告基因質(zhì)粒，在293T細胞中，分別轉(zhuǎn)染野生型與突變性DNMT1-3'UTR質(zhì)粒，4小時后將miR-217化學模擬物(mimics)轉(zhuǎn)染細胞，48小時后溶解細胞，熒光素酶檢測系統(tǒng)分析熒光強度。構(gòu)建含DNMT1 shRNA序列的慢病毒載體，通過在年青組HSF中抑制DNMT1的表達量來檢測HSF的衰老表型。利用第二部分中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的年青組HSF，提取細胞總蛋白，利用we

10、sternblot法檢測DNMT1的蛋白表達量，并在過表達miR-217的年青組HSF中，轉(zhuǎn)染DNMT1-cDNA質(zhì)粒，衰老β-半乳糖苷酶染色法檢測HSF的衰老相關染色率。
　　結(jié)果:MICRORNA.ORG網(wǎng)站預測到miR-217的3'UTR區(qū)域可以直接靶向DNMT1的序列。熒光素酶報告基因檢測顯示，野生型的DNMT1-3'UTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，過表達miR-217后，熒光量較未過表達組下降(P＜0.05)，而突變型的DNMT1-3

11、'UTR轉(zhuǎn)染組未發(fā)生明顯變化。年青組HSF中抑制DNMT1的表達量后，細胞增殖能力明顯減弱(P＜0.05)，衰老β-半乳糖苷酶染色率明顯上升(P＜0.01);年青組HSF中過表達miR-217后，DNMT1的蛋白表達量明顯下降(P＜0.01);同時轉(zhuǎn)染含hsa-miR-217 shRNA和DNMT1-shRNA序列的慢病毒載體后，較單獨下調(diào)hsa-miR-217組，衰老β-半乳糖苷酶染色率上升(P＜0.05)。
　　結(jié)論:DNMT