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文檔簡介
1、目的:
研究非對稱性二甲基精氨酸(asymmetrical dimethylarginine,ADMA)對人皮膚成纖維細胞(Human skin fibroblasts,HSF)衰老的影響及其可能機制。
方法:
1.用高效液相色譜(HPLC)法測定自然衰老和光老化皮膚組織和成纖維細胞中ADMA的濃度。
2.原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞,MTT比色法評價ADMA對HSF增殖的影響,確定最
2、佳藥物處理濃度。
3.不同濃度ADMA(10,30,50μM)作用于HSF,48小時后,用β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性,活性氧檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)濃度,免疫印跡法(western-bolt)檢測磷酸化p38 MAPK,衰老相關(guān)蛋白P16、MMP-1的改變。
4.預先加入P38抑制劑SB203580(10μM)或抗氧化劑N
3、-乙酰半胱氨酸(NAC)(10μM)1小時后,再加入ADMA(50μM)處理,上述同樣的方法檢測以上指標。
結(jié)果:
1.年老組皮膚組織和成纖維細胞中ADMA含量均明顯高于兒童組(P<0.05),同一人中曝光部位皮膚組織中ADMA含量明顯高于非曝光部位(P<0.05),UVA照射后HSF中ADMA的含量明顯升高(P<0.05)。
2.ADMA能抑制人皮膚成纖維細胞的增殖,且隨濃度增加,抑制能力也相
4、應增強,IC50=51.47±1.013μM。
3.不同濃度ADMA(10,30,50μM)處理HSF48小時后,細胞密度減少、細胞變大變圓,β-半乳糖苷酶染色率、衰老相關(guān)蛋白P16均隨ADMA濃度的增加而增加(P<0.05),細胞出現(xiàn)衰老表型。
4.不同濃度ADMA(10,30,50μM)處理HSF后,ROS水平隨濃度增加而增加,磷酸化p38MAPK、MMP-1蛋白亦隨濃度逐漸增加(P<0.05)。
5、 5.P38抑制劑SB203580(10μM)能顯著下降A(chǔ)DMA所致的β-半乳糖苷酶染色率、P16蛋白及MMP-1蛋白的升高;抗氧化劑NAC(10μM)亦能明顯下降A(chǔ)DMA所致的β-半乳糖苷酶染色率、P16蛋白、ROS濃度、磷酸化p38 MAPK及MMP-1蛋白的升高。
結(jié)論:
1.自然衰老和光老化皮膚組織及成纖維細胞中ADMA的含量顯著上升,ADMA在皮膚衰老過程中起重要作用;
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