人胎腦神經(jīng)干細(xì)胞植入新生鼠缺血缺氧性海馬損傷區(qū)的研究.pdf

1、目的:將培養(yǎng)的人神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSC)移植至新生鼠缺血缺氧性腦損傷(HIBI)的海馬區(qū)，觀察植入細(xì)胞的遷移及分化。探索缺血缺氧性腦病(HIE)的治療方法。 材料與方法:1.細(xì)胞培養(yǎng)：取孕12周人胚胎腦組織，制備成單細(xì)胞懸液，接種于N2培養(yǎng)基中(D/F12+N2+B27)，細(xì)胞接種濃度為3～5×105/ml，培養(yǎng)基中添加表皮生長因子(EGF)20ng/ml、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basicfibro

2、blastgrowthfactorbFGF)10ng/ml、白血病抑制因子(LIF)10ng/ml,培養(yǎng)十天后，添加10％胎牛血清(fetalbovineserumFBS)誘導(dǎo)分化4-5天，形成含5-30個細(xì)胞的小神經(jīng)細(xì)胞球。細(xì)胞球經(jīng)低速離心濃縮，在N2培養(yǎng)基中調(diào)整細(xì)胞終濃度為5.0×104cells/ul，待移植時用?！　?.神經(jīng)干細(xì)胞移植：SD新生大鼠(n=32)生后第7天進(jìn)行HIBD模型制作，模型制作后3天予人NSC移植。準(zhǔn)備移

3、植的幼鼠麻醉后固定在立體定向儀上，人NSC注入左側(cè)(損傷側(cè))海馬區(qū)，注射位點(diǎn)如下：AP=-3mm，ML=-2.5mm，DV=-2mm。通過微量注射器注射2ul(細(xì)胞濃度為5.0×104cells/ul)。移植后動物不予免疫抑制劑。移植后1周、2周、4周及3月的鼠過量麻醉后，4％的多聚甲醛心臟灌注，取腦，石蠟包埋，冠狀切片(5um)，用鼠抗－人細(xì)胞核蛋白(humannuclearprotein，hNuc)，兔抗－人神經(jīng)絲蛋白(neurof