針刺誘導(dǎo)缺血缺氧模型鼠皮層神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的研究.pdf

1、背景：新生兒缺血缺氧性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)是圍產(chǎn)期腦損傷的主要原因,嚴(yán)重威脅著新生兒的生命和健康，主要表現(xiàn)為中樞性運(yùn)動(dòng)障礙及姿勢(shì)異常，同時(shí)常伴有智力發(fā)育遲緩、學(xué)習(xí)困難、行為和情感異常等障礙?1-3?,是導(dǎo)致新生兒死亡或幸存者永久性神經(jīng)功能損害、智能落后的重要原因之一。降低新生兒HIE死亡率及神經(jīng)損害的發(fā)生，關(guān)鍵在于進(jìn)行早期診斷、準(zhǔn)確判斷腦損傷程度，早期及時(shí)合理的治療措施。研究表明

2、磁共振擴(kuò)散加權(quán)成像(diffusion weighted imaging，DWI)的成像技術(shù)在HIE的早期診斷、損傷程度判斷等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[4]。本課題組根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，以“補(bǔ)先天之精，調(diào)后天之本，充腦髓，壯骨，解痙”為原則，在臨床上采用針刺任脈、督脈及膀胱經(jīng)聯(lián)合治療多例各型腦癱患兒，均取得不同程度的改善甚或痊愈[5]，為早期針刺治療提供了明確的實(shí)踐證據(jù)。
　　目的：本實(shí)驗(yàn)首先采用一側(cè)結(jié)扎頸總動(dòng)脈結(jié)合缺氧的方法制作新生乳鼠缺血

3、缺氧腦損傷動(dòng)物模型，然后應(yīng)用7.0 T高場(chǎng)動(dòng)物核磁共振掃描儀超早期觀察并動(dòng)態(tài)追蹤活體模型鼠在不同干預(yù)因素處理后腦部的改變情況，探討新生乳鼠缺血模型的評(píng)價(jià)方法，早期模擬臨床針刺任脈、督脈及膀胱行針刺治療；后期再應(yīng)用水迷宮觀察針刺前后實(shí)驗(yàn)鼠的空間學(xué)習(xí)及記憶能力變化；以期肯定針刺任脈、督脈及膀胱經(jīng)等穴位的確切療效,探討針刺療法對(duì)于HIE的預(yù)后的影響，并為針刺治療HIE的作用機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：新生7日齡SD幼鼠結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈

4、并缺氧2小時(shí)制作新生鼠缺血缺氧性腦病模型，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常組，模型組，針刺治療組及隨意針刺組，模型建立后第二天起予針刺治療，隨意針刺組無原則實(shí)施針刺，治療組及隨意針刺組均每天針刺一次，模型組及正常組不做針灸處理。在模型建立完成后12h內(nèi)行頭部MRI掃描，觀察模型建立成功與否以及缺血缺氧病灶累及范圍，同時(shí)測(cè)定病灶中心的表觀擴(kuò)散系數(shù)（ADC值），各組大鼠在針刺治療后14天、28周和2月分別用磁共振（MRI）動(dòng)態(tài)觀察其皮層發(fā)育情況，計(jì)算病

5、灶部位皮層厚度，并比較各組之間的差異。應(yīng)用GFP立體定位顯微活體注射標(biāo)記增殖分裂的細(xì)胞，并用免疫熒光觀察腦皮層神經(jīng)元標(biāo)記物MAP-2的表達(dá)，比較各組陽性細(xì)胞數(shù)目之間的差異。并在針刺治療后28天，水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察針刺后模型動(dòng)物的行為變化，分別觀察穿越平臺(tái)次數(shù)及在目的象限停留時(shí)間這兩個(gè)敏感指標(biāo)，并比較各組之間的差異。
　　結(jié)果：
　　1.MRI掃描提示模型建立成功，觀看到缺血缺氧病灶累及皮層及海馬等層面,測(cè)量病灶中心區(qū)ADC值為(

6、3.351±0.094)x10-4mm2/s，低于重度缺血缺氧最終平均ADC值范圍。
　　2. MRI動(dòng)態(tài)觀察缺血缺氧模型鼠腦內(nèi)皮層厚度變化情況：治療組與其他兩組實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間段的皮層厚度對(duì)比，在針刺治療14天后，治療組與模型組、隨機(jī)針刺組比較 P<0.05；在針刺治療28天后，治療組與模型組、隨機(jī)針刺組比較 P<0.01；在針刺治療2月后，治療組與模型組、隨機(jī)針刺組比較 P<0.01,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3. GFP轉(zhuǎn)

7、染情況：治療組中攜帶GFP陽性細(xì)胞數(shù)目比正常組、模型組及隨意針刺組明顯增多，P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.免疫熒光染色情況：治療組中MAP-2陽性細(xì)胞數(shù)目比正常組、模型組及隨意針刺組明顯增多，P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.在水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，治療組穿越平臺(tái)次數(shù)及在目的象限停留時(shí)間優(yōu)于其他兩組實(shí)驗(yàn)組，P<0.05,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：磁共振可以作為一種無創(chuàng)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)手段用于超早

8、期觀察缺血缺氧腦損傷程度及病灶受累及部位、范圍，并可為針刺治療提供動(dòng)態(tài)的、直觀的評(píng)估，極具臨床意義。本實(shí)驗(yàn)通過大體形態(tài)、HE染色鏡下觀察及MRI掃描，縱觀三種方法所得的結(jié)果互相吻合，動(dòng)物發(fā)育情況及病理染色顯示用改良的建模方法建立的動(dòng)物模型腦部缺血缺氧病理變化確切，說明新生大鼠HIE模型建立成功。針刺任督二脈及膀胱經(jīng)能促進(jìn)HIE模型鼠皮層及海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分裂潛能，經(jīng)治療后新生的神經(jīng)干細(xì)胞能大部分分化為神經(jīng)元，提示在缺血缺氧中喪失的神