神經(jīng)干細(xì)胞移植治療缺氧缺血性腦病新生鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞（Neural Stem Cells，NSCs）移植聯(lián)合粒細(xì)胞集落刺激因子（C-ranulocyte Colony-Stimulating Faotor，G-CSF）對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦?。℉ypoxio Isohemio Enoephalopathy，HIE）模型進(jìn)行治療，從整體水平、細(xì)胞水平、分子生物學(xué)水平觀察治療后的效果，為臨床更有效的治療新生兒缺氧缺血性腦?。℉ypoxio-Ischemio

2、 Encephalopathy，HIE）提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.NSCs的制備及鑒定取人胚胎腦組織，培養(yǎng)獲取生長旺盛的NSCs球，分散制成含小細(xì)胞球的細(xì)胞懸液，加入50μg/ml的DAPI溶液標(biāo)記細(xì)胞核，待移植用。應(yīng)用免疫熒光方法，以抗.神經(jīng)巢蛋白（Nestin）鑒定細(xì)胞NSCs特性。誘導(dǎo)分化后，以抗β-Ⅲ-tubulin抗體鑒定神經(jīng)元，抗GFAP抗體鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　 2.模型動(dòng)物分組及G

3、-CSF注射7日齡Wistar乳鼠，麻醉后雙重結(jié)扎并剪斷左側(cè)頸總動(dòng)脈，恢復(fù)2～4小時(shí)后，放入8％02+92％N2的容器中2.5小時(shí)，用水浴箱控制環(huán)境溫度在39℃左右。將存活動(dòng)物隨機(jī)分為三組，HIE組（A組），NSCs移植組（B組），NSCs移植+G-CSF治療組（C組）。其中C組于建模完成后1h給予G-CSF，注射劑量為50μg.（kg·d）-1，每天一次，連續(xù)注射5天。
　　 3.NSCs移植B組和c組動(dòng)物在模型制作后第2天行

4、NSCs移植，將幼鼠麻醉后固定在立體定向儀上，將制備好的NSCs（細(xì)胞濃度約為1×105/μL）懸液5μL勻速緩慢注入左側(cè)（損傷側(cè)）側(cè)腦室，A組動(dòng)物移植入等量生理鹽水。移植后不予免疫抑制劑。
　　 4.行為學(xué)及解剖觀察建模完成后以及設(shè)定時(shí)間點(diǎn)對(duì)各組大鼠進(jìn)行mNSS評(píng)分，并對(duì)各組大鼠大腦重量進(jìn)行測定，行TTC染色，比較大腦梗死灶。
　　 5.組織檢測設(shè)定時(shí)間點(diǎn)將各組大鼠斷頭取腦，按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容不同分別制作石蠟、冰凍切片，行HE

5、及Niss1染色，觀察大腦神經(jīng)元的損傷情況，應(yīng)用免疫熒光方法檢測植入細(xì)胞存活、遷移、分化情況。通過圖像處理軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)比B組和C組植入細(xì)胞存活、遷移、分化情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.NSCs的鑒定人胎腦組織分離的細(xì)胞體外培養(yǎng)獲取生長旺盛的干細(xì)胞球，免疫熒光標(biāo)記后，大部分細(xì)胞表達(dá)NSCs標(biāo)志Nestin，誘導(dǎo)分化后，對(duì)分化細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物β-Ⅲ-tubulin、GFAP的鑒定，證明

6、所獲細(xì)胞具有NSCs特性，且DAPI標(biāo)記后不影響其活性。
　　 2.NSCs移植移植后可見DAPI陽性的植入細(xì)胞存活，并向周圍擴(kuò)散，分布集中在海馬、額葉皮層、腦干和小腦，細(xì)胞形態(tài)與所處腦組織部位的細(xì)胞形態(tài)相似。
　　 3.mNSS評(píng)分建模完成后所有大鼠的mNSS評(píng)分較高。NSCs移植后，移植組評(píng)分較對(duì)照組明顯降低，且C組評(píng)分較B組評(píng)分明顯減低，表明經(jīng)聯(lián)合治療后大鼠的運(yùn)動(dòng)行為能力有所改善。
　　 4.解剖學(xué) NSC

7、s移植后1周和2周大腦重量明顯高于A組（F值分別為42.38和121.76，P<0.01），且C組大腦重量明顯高于B組（t值分別為2.36和2.63，P<0.05）；NSCs移植后4周大腦重量明顯高于A組（F=58.22，P<0.01），B組和C組比較無顯著性差異。TTC染色顯示移植后C組梗死灶體積較A組減小。
　　 5.HE染色及尼氏染色移植后2周，A組皮層神經(jīng)元及海馬錐體細(xì)胞變性壞死，細(xì)胞呈空泡狀，尼氏小體缺失；B組病理變化

8、較A組輕，細(xì)胞排列較有序，仍可見斑點(diǎn)狀神經(jīng)元變性、壞死；而C組細(xì)胞排列相對(duì)整齊，形態(tài)較規(guī)則，未見變性壞死的神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)布滿深藍(lán)色尼氏小體。
　　 6.TUNEL檢測 NSCs移植術(shù)后3天，B組大腦皮層見大量的植入細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)，而C組的植入細(xì)胞凋亡明顯減少（181.07±14.16/20倍視野VS73.20±14.01/20倍視野），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=68.37，P<0.01）。
　　 7.免疫熒光 NSCs

9、移植術(shù)后1、2、4周觀察B組和C組大腦組織中植入細(xì)胞。
　　 ①通過DAPI檢測到植入細(xì)胞從腦室向外遷移，損傷側(cè)可見DAPI陽性細(xì)胞存在，以額葉皮層和海馬多見，紋狀體及顳葉皮層亦有少許植入細(xì)胞分布。B組的陽性細(xì)胞數(shù)少于C組（726.31±142.33/mm2 VS851.04±105.75/mm2），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.07，P<0.01）。植入后2周，更多的移植細(xì)胞到達(dá)損傷區(qū)，B組植入細(xì)胞數(shù)仍少于C組（923.45±

10、121.49/mm2VS944.64±117.55/mm2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.5，P<0.05）。植入后4周，2組細(xì)胞數(shù)量均有所減少，細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.47，P>0.05）。
　　 ②通過DAPt+β-Ⅲ-mbulin雙標(biāo)檢測到植入細(xì)胞分化成的神經(jīng)元。其分布以皮層、海馬為主。移植后1周，皮層部位兩組植入細(xì)胞分化的神經(jīng)元數(shù)量上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.66，P>0.05）。而海馬各區(qū)主要位于顆粒細(xì)胞層，C

11、組神經(jīng)元分化存活數(shù)量較B組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.02，.P<0.01）。移植后2周，皮層及海馬C組神經(jīng)元分化存活數(shù)量較B組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為4.78和2.87，P<0.01）。
　　 ③通過DAPI+GFAP雙標(biāo)檢測到植入細(xì)胞分化成的星形膠質(zhì)細(xì)胞。其數(shù)量較少，見于紋狀體、白質(zhì)，皮層亦可見散在分布，移植后1周，C組植入細(xì)胞分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較B組多（53.57±18.22/mm2 VS47.42±17.8

12、1/mm2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=：4.83，P<0.01）。移植后2周，兩組植入細(xì)胞分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.59，P>0.05）。
　　 ④通過DAPI+Olig2雙標(biāo)檢測植入細(xì)胞分化成的少突膠質(zhì)細(xì)胞。NSCs植入側(cè)腦室后，幾乎不能分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞，偶可見到DAPI和Olig2雙陽性細(xì)胞，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.人胎腦組織在體外含EGF和bFGF的無血清培養(yǎng)