人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療新生鼠缺氧缺血性腦損傷的研究.pdf

1、研究背景 新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-isehemic brain damage，HIBD)是造成兒童智能傷殘的主要原因之一。目前對(duì)缺氧缺血性腦損傷后修復(fù)治療是一個(gè)尚未解決的世界性難題。源于胚胎組織的神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem ceHs，NSC)曾被認(rèn)為是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的希望，但因其利用來(lái)源的缺乏和倫理道德的約束而受到明顯的限制。近期文獻(xiàn)報(bào)道，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchy

2、mal stem ceils，BM-MSCs)作為一種多潛能干細(xì)胞，在體外一定條件下可向骨、肌肉、肝臟、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元分化，骨髓MSCs移植已用于多種疾病的實(shí)驗(yàn)研究。但是，骨髓來(lái)源的MSCs因其有被病毒污染的可能和隨著年齡的增長(zhǎng)細(xì)胞數(shù)量及擴(kuò)增和分化的能力均明顯下降等特點(diǎn)，它作為種子細(xì)胞用于移植治療的能力也因此受到極大的限制。故尋找一種能替代骨髓MSCs，并可彌補(bǔ)其缺陷的干細(xì)胞來(lái)源是非常必要的。 已有研究表明，人臍血(hu

3、man umbilical cord blood，HUCB)中含有豐富的造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞(hematopoietie stem cell/hematopoietic progenitor cell，HSC/HPC)，臍血中的造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞已成功的用于臨床的異體細(xì)胞移植治療。但有關(guān)臍血中是否含有MSCs目前仍有爭(zhēng)議。有一些學(xué)者認(rèn)為在正常足月生產(chǎn)的胎兒臍血中不存在MSCs，或認(rèn)為在足月分娩的臍帶血中MSCs的含量極低，而不能滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)和

4、臨床的需要。近年來(lái)許多研究證實(shí)，從臍血中可成功培養(yǎng)出MSCs，且臍血MSCs具有與骨髓MSCs相似的性質(zhì)，具有較強(qiáng)的可塑性和多向分化潛能，臍血MSCs在體外特定的條件下可定向分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。臍血MSCs移植治療在缺氧缺血性腦損傷和腦脊髓損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，觀察到移植細(xì)胞在腦組織內(nèi)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)和神經(jīng)功能的恢復(fù)。 已有的臍血MSCs移植實(shí)驗(yàn)大多針對(duì)于成年動(dòng)物缺氧缺血性腦損傷和局灶性腦外傷模型的研究，但對(duì)

5、新生動(dòng)物移植研究較為少見(jiàn)；而且，其移植途徑多為顱內(nèi)和腦室內(nèi)移植，此易造成額外的腦損傷。研究表明，新生宿主與成年宿主對(duì)干細(xì)胞移植存在著許多差異。未成熟腦處于快速發(fā)育時(shí)期，腦內(nèi)含有較成年宿主更多的神經(jīng)分泌細(xì)胞，故新生宿主腦組織具有MSCs移植后增殖、分化、遷移與整合的兼容環(huán)境。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，新生宿主移植神經(jīng)干細(xì)胞在腦內(nèi)遷移較成年宿主廣泛，定向分化能力較強(qiáng)；新生宿主血腦屏障未發(fā)育成熟，處于“相對(duì)開(kāi)放”狀態(tài)，研究證實(shí)移植細(xì)胞可通過(guò)新生動(dòng)物的血腦

6、屏障進(jìn)入腦內(nèi)，提示可選擇外周靜脈移植；新生宿主免疫機(jī)能不完善，故發(fā)生移植相關(guān)性移植物抗宿主疾病(g～raft-versus-host disease，GVHD)較少，異體移植成功率較高。總之，新生宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)發(fā)育的特點(diǎn)決定了其接受臍血MSCs移植將會(huì)有令人更加振奮的效果。 目的 本研究首先論證在足月正常生產(chǎn)的胎兒臍帶血中是否可分離出MSCs，探索在體外培養(yǎng)、純化和擴(kuò)增臍血MSCs的方法；研究臍血MSCs

7、的生物學(xué)特性，并進(jìn)一步誘導(dǎo)臍血MSCs向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。然后，分別通過(guò)腦內(nèi)海馬部位移植和腦損傷后不同時(shí)間血液移植人臍血MSCs治療HIBD新生大鼠，觀察臍血MSCs移植對(duì)HIBD新生大鼠的神經(jīng)功能的恢復(fù)及移植細(xì)胞在腦組織內(nèi)的分化情況，以探討臍血MSCs移植治療新生大鼠HIBD的療效及外周血液移植的可行性，為進(jìn)一步進(jìn)行臍血MSCs移植治療新生兒HIBD的臨床應(yīng)用，及選擇最佳移植途徑和治療時(shí)間提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論根據(jù)。 方法

8、 1、人臍血MSCs的體外培養(yǎng)和生物學(xué)特性研究 無(wú)菌條件下采取健康育齡產(chǎn)婦正常足月分娩胎兒的臍帶血38份臍血，采用常規(guī)的骨髓MSCs培養(yǎng)法(Friedenstein法)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。密度梯度離心法分離臍血單個(gè)核細(xì)胞(mononuclearcells，MNCs)，單個(gè)核細(xì)胞以l×10<'8>cells/ml密度接種在FCS預(yù)包被的F25培養(yǎng)瓶中，加入含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基(PH值為713)5ml，將培養(yǎng)

9、瓶置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5％CO<,2>的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3d后全量換液，去除未貼壁細(xì)胞，后每3d全量換液。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80％-90％融合，按1：2的比例以1×10<'6>cells/ml密度接種進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取P3代MSCs用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs的免疫表型CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、CD106的表達(dá)。 2、人臍血MSCs向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn) 取P3代臍血MSCs進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)

10、，分為三組：①化學(xué)因子誘導(dǎo)，先用含有3mmol/Lβ-疏基乙醇的DMEM/F12(含20％FCS)培養(yǎng)液預(yù)誘導(dǎo)24h，換成含20g/L二甲基亞砜(DMSO)和200mmol/L丁化羥基苯甲醚(BHA)的無(wú)血清DMEM/F12進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；②生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)，含20％FCS的DMEM/F12培養(yǎng)液中加入含表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growt

11、h factor，bFGF) (終濃度均為各10ng/ml的)誘導(dǎo)分化劑誘導(dǎo)培養(yǎng)臍血MSCs；③神經(jīng)培養(yǎng)液(HIBD新生sD大鼠腦組織培養(yǎng)上清液)+生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)(加入含EGF和bFGF終濃度均為各10ng/ml的誘導(dǎo)分化劑)誘導(dǎo)培養(yǎng)臍血MSCs，與神經(jīng)培養(yǎng)液培養(yǎng)誘導(dǎo)對(duì)照。各組取細(xì)胞爬片，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)誘導(dǎo)后的細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin、神經(jīng)元標(biāo)志物MAP<,2>和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的表達(dá)。 3、人臍血M

12、SCs移植治療新生大鼠HIBD的研究 7日齡SD大鼠經(jīng)左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后，予8％氧氣和92％氮?dú)獾脱跆幚?h，建立HIBD動(dòng)物模型。假手術(shù)組(Sham組，n＝12)，62只HIBD新生大鼠隨機(jī)分為5組：假移植組(n＝12)，腦內(nèi)移植組(n＝13)，血液移植Ｉ組(n＝13，心內(nèi)穿刺時(shí)死亡3只)，血液移植Ⅱ組(n＝12)和血液移植Ⅲ組(n＝12)。移植前用熒光染劑DAPI染色標(biāo)記臍血MSCs。腦內(nèi)移植組于缺氧缺血(hypoxia-

13、ischemia，HI)后24h左側(cè)海馬部位腦內(nèi)注射MSCs懸液20ul；血液移植Ⅰ組(因新生大鼠無(wú)法建立外周血管途徑，選擇心內(nèi)注射移植)，于HI后24h心內(nèi)注射MSCs懸液20ul；血液移植Ⅱ組和血液移植Ⅲ組分別于HI后7d、14d尾靜脈注射臍血MSCs懸液20ul。每組分別于生后3w、5w進(jìn)行Y型迷宮試驗(yàn)評(píng)價(jià)其學(xué)習(xí)記憶能力；于生后3w、5w行多聚甲醛灌注取腦，制備腦組織切片，并分別行HE染色和免疫組織化學(xué)熒光檢測(cè)MAP<,2>、GF

14、AP細(xì)胞標(biāo)記。結(jié)果 1、人臍血MSCs的體外培養(yǎng)和生物學(xué)特性研究結(jié)果 38份臍血中單個(gè)核細(xì)胞原代培養(yǎng)，18 份觀察到MSCs樣細(xì)胞生長(zhǎng)，其中僅6份傳代培養(yǎng)成功，20份培養(yǎng)細(xì)胞以大的扁圓形細(xì)胞破骨細(xì)胞為主，但不能傳代。原代和第3代臍血MSCs的生長(zhǎng)特性進(jìn)行觀察比較，原代MSCs在接種后的2-5d為生長(zhǎng)的潛伏期；10-14d以后細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，3-4周左右逐漸進(jìn)入平臺(tái)期；P3代臍血MSCs擴(kuò)增速度明顯快于原代培養(yǎng)，2

15、-4d倍增1次，5-8d后細(xì)胞進(jìn)入到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，10-14d進(jìn)入平臺(tái)期。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代的臍血MSCs結(jié)果顯示，P3代MSCs不表達(dá)或極弱表達(dá)CD34、CD45、CDI06造血細(xì)胞標(biāo)志，穩(wěn)定地高表達(dá)CD29、CD44、CD105間充質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的表面抗原標(biāo)記。這與骨髓MSCs的表面抗原標(biāo)志相一致。表明臍血MSCs是存在于臍血中區(qū)別于造血細(xì)胞的一群處于未分化狀態(tài)的非定向干/祖細(xì)胞。 2、人臍血MSCs的向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)

16、驗(yàn)結(jié)果 臍血單個(gè)核細(xì)胞及P3代MSCs在未培養(yǎng)和誘導(dǎo)前均存在著Nestin、MAP<,2>的弱表達(dá)。三種不同誘導(dǎo)條件下，MSCs誘導(dǎo)后的細(xì)胞不僅在形態(tài)上向神經(jīng)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而且有神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物MAP<,2>、GFAP的表達(dá)，各組MAP<,2>和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的比率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增多；而Nestin陽(yáng)性細(xì)胞比率誘導(dǎo)初期出現(xiàn)增高，但隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。神經(jīng)培養(yǎng)液和生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)組，臍血MSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程

17、相對(duì)溫和，分化后細(xì)胞存活率高，其中以神經(jīng)培養(yǎng)液+生長(zhǎng)因子組細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞較早、產(chǎn)生MAP<,2>和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞比率較高(P<0.05)?；瘜W(xué)因子誘導(dǎo)組，雖誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞效率較高，但誘導(dǎo)后細(xì)胞存活時(shí)間短，一般在3d后大部分細(xì)胞死亡。 3、人臍血MSCs體外培養(yǎng)移植治療新生大鼠HIBD的研究結(jié)果 腦內(nèi)移植、血液移植Ⅰ組和血液移植Ⅱ組大鼠腦組織內(nèi)均可見(jiàn)大量DAPI標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞，其中3-9％植入細(xì)胞表達(dá)MAP<

18、,2>或GFAP。DAPI標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞均以腦損傷側(cè)海馬、紋狀體多見(jiàn)。損傷側(cè)腦組織部分血管內(nèi)皮細(xì)胞處顯示DAPI標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞。生后5w時(shí)腦內(nèi)植入細(xì)胞較3w是明顯減少。而血液移植Ⅲ組大鼠腦內(nèi)3w時(shí)僅有少量DAPI標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞，5w時(shí)消失。Y型迷宮試驗(yàn)，腦內(nèi)移植、血液移植Ⅰ組和血液移植Ⅱ組較假移植組學(xué)會(huì)次數(shù)均減少，記憶保存百分率明顯增高，提示腦內(nèi)移植和早期血液移植臍血MSCS移植可明顯提高HIBD新生大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力；5w時(shí)血液移植Ⅰ組學(xué)

19、習(xí)記憶能力優(yōu)于其它組，提示早期(24h)血液移植的遠(yuǎn)期療效最佳。腦內(nèi)移植、血液移植Ⅰ組和血液移植Ⅱ組均可減輕新生大鼠HZBD后海馬CA<,1>區(qū)神經(jīng)細(xì)胞壞死，其中腦內(nèi)移植和血液移植Ⅰ組移植效果較為顯著。結(jié)論 1．在適宜的體外培養(yǎng)條件下，可從健康產(chǎn)婦足月胎兒臍血中成功地培養(yǎng)出 MSCs，但臍血MSCs數(shù)量少、建立時(shí)間較長(zhǎng)和頻率低是其主要特點(diǎn)。臍血 MSCs的免疫表型符合間充質(zhì)干細(xì)胞特征。 2．臍血MSCs在體外特定的誘導(dǎo)

20、培養(yǎng)和微環(huán)境條件下，能向神經(jīng)干細(xì)胞方向分化，并能分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。生長(zhǎng)因子和神經(jīng)條件培養(yǎng)基可高效誘導(dǎo)MSCs轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。 3．HIBD新生大鼠早期血液移植和腦內(nèi)海馬部位移植人臍血MSCs，植入的臍血MSCs可在腦內(nèi)存活、遷移，與腦組織良好整合，并分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)缺失的神經(jīng)細(xì)胞具有修復(fù)替代作用。 4．臍血MSCs移植可有效減輕HIBD大鼠海馬CA1區(qū)的細(xì)胞損傷，并有效改善HIBD新生