大鼠胎腦神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng)及電穿孔轉(zhuǎn)染.pdf

1、研究背景：神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）的發(fā)現(xiàn)和分離成功，打破了神經(jīng)細胞不能再生的傳統(tǒng)理論。同時神經(jīng)干細胞具有自我增殖，多向分化，無免疫原性等特點，已成為轉(zhuǎn)基因治療的理想載體細胞。近年來研究表明，神經(jīng)干細胞轉(zhuǎn)基因移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病作為一種新的治療手段，已經(jīng)在創(chuàng)傷性腦脊髓損傷、腦血管病、退行性疾病、遺傳代謝性疾病、腦腫瘤等動物模型中進行了實驗，取得了一定的療效。血管內(nèi)皮細胞生長因子（Vascular en

2、dothelial growth factor，VEGF）是1989年Ferrara等在牛垂體濾泡星狀細胞體外培養(yǎng)液中首先純化出來的糖類蛋白質(zhì)，其相對分子量為34～45kD，是由兩個相對分子量為17～22kD的亞基通過二硫鍵連接而成的二聚體，能特異性地作用于血管內(nèi)皮細胞，促進血管內(nèi)皮細胞增殖，加速新生血管的形成，增加血管通透性，并有直接的神經(jīng)保護和促神經(jīng)發(fā)生作用。 基因治療成功的關(guān)鍵是外源基因的轉(zhuǎn)染效率和表達強度。目前將外源基因

3、導入真核細胞的方法有很多種，可分為兩大類：病毒轉(zhuǎn)染法和非病毒轉(zhuǎn)染法。病毒轉(zhuǎn)染法具有很高的轉(zhuǎn)染效率，但其存在安全和技術(shù)方面的缺點，從而限制了病毒轉(zhuǎn)染法的廣泛應用。在非病毒轉(zhuǎn)染法中，最常用的是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和電穿孔轉(zhuǎn)染。而脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞，其轉(zhuǎn)染效率僅為5％～15％。 目的：從SD胎鼠腦組織中分離培養(yǎng)出神經(jīng)干細胞，并尋找一種能高效轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞的非病毒轉(zhuǎn)染方法。 方法：本實驗首先從SD胎鼠腦組織中分離NSCs，在體外采用

4、無血清懸浮培養(yǎng)法進行培養(yǎng)和擴增，利用免疫熒光組織化學技術(shù)對NSCs及其分化細胞進行鑒定。然后構(gòu)建和鑒定真核表達質(zhì)粒pEGFP-N1/VEGF165。再使用電穿孔技術(shù)將質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)染入NSCs，利用其表達的綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）作為轉(zhuǎn)染成功的報告物或標記物，在熒光顯微鏡下根據(jù)發(fā)出綠色熒光的NSCs數(shù)量，計算出轉(zhuǎn)染效率。 結(jié)果：從SD胎鼠腦組織中分離的細胞在體外可長時間

5、自我增殖，原代及傳代克隆細胞均表達NSCs的特異性抗原Nestin，且誘導分化后可表達星型膠質(zhì)細胞的特異性抗原-膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）和神經(jīng)元的特異性抗原-神經(jīng)元特異性烯醇化酶（Neuron-specific enolase，NSE）。通過酶切及測序鑒定，表明pEGFP-N1/VEGF165構(gòu)建成功。同時用電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)染神經(jīng)于細胞，其效率可達20％～70％，平均30％