HPV6bL1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及免疫原性分析.pdf

1、目的 間接免疫熒光技術(shù)在臨床與基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用較為廣泛，但卻極少有人用于尖銳濕疣的檢測，我們旨在驗(yàn)證該方法是否可行，并將之與PCR方法相比較，以了解其準(zhǔn)確性和敏感性。 材料和方法 60例臨床確診的尖銳濕疣疣體標(biāo)本均取自性病門診，采取疣體印片，用小鼠抗人的HPV6型作為I抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG作為II抗，在熒光顯微鏡下檢查。剩余標(biāo)本消化后做PCR，證實(shí)有無人乳頭瘤病毒（Human papillomavi

2、rus，HPV）的DNA，并用RFLP方法進(jìn)行分型。 結(jié)果 34例尖銳濕疣標(biāo)本中檢測到特異性熒光，陽性率為56.67％，而用PCR方法檢測到58例陽性，陽性率為96.67％。用X2檢驗(yàn)比較二者的陽性率，P<0.01。主要感染類型為6和11型，占98.28％。 結(jié)論 間接免疫熒光技術(shù)針對(duì)的是HPV的衣殼蛋白，能檢測有完整衣殼的成熟HPV，操作簡便，有望用于宮頸涂片的常規(guī)檢查，以篩查HPV攜帶者，對(duì)預(yù)防宮頸癌

3、提供幫助。但敏感性不及PCR技術(shù)。 目的 尖銳濕疣是目前全球最常見的性傳播疾?。╯exually transmitted diseaseas,STD）之一，目前的治療方法復(fù)發(fā)率高，給患者帶來很大痛苦，經(jīng)濟(jì)上帶來沉重的負(fù)擔(dān)。HPV是尖銳濕疣的病原體，而北京地區(qū)又以HPV6 b為主。對(duì)HPV致病機(jī)理及機(jī)體免疫學(xué)的認(rèn)識(shí)是疫苗研究的基礎(chǔ)。目前針對(duì)尖銳濕疣以預(yù)防性疫苗為主，主要引起機(jī)體的體液免疫，產(chǎn)生特異性抗體，以中和病毒。我們希

4、望構(gòu)建一種可誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫功能、又制備工藝簡單的DNA疫苗。 材料與方法 第一階段：采用pcDNA3.1作為表達(dá)載體，將HPV6b的L1片段插入其中，在大腸桿菌中克隆擴(kuò)增，并進(jìn)行酶切及測序鑒定是否構(gòu)建成功。第二階段：將構(gòu)建成功的質(zhì)粒pcDNA3.1-HPV6b L1轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，并分別用免疫熒光染色及蛋白免疫印跡驗(yàn)證質(zhì)粒能否在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。第三階段：在此基礎(chǔ)上免疫BALB/c雌性小鼠，共分三組，每組六

5、只。第一組用pcDNA3.1-HPV6b L1免疫，第二組用pcDNA3.1-0，以上兩組每只小鼠肌注三次，每兩周一次，每次注射100μg，第三組不注射作為陰性對(duì)照。第三次免疫兩周后處死小鼠，取血及脾，檢測抗L1抗體滴度及脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子IL-2，IL-4，IFN-γ的分泌水平。 結(jié)果 第一階段：酶切出現(xiàn)目的片段，測序結(jié)果與預(yù)期插入的片段一致，證實(shí)pcDNA3.1-HPV6b L1已成功構(gòu)建。第二階段：pcDNA3.1

6、-HPV6b L1轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞24h后在胞核出現(xiàn)了陽性熒光信號(hào)；免疫印跡出現(xiàn)了陽性條帶，說明轉(zhuǎn)染成功，所構(gòu)建質(zhì)粒能在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。第三階段：pcDNA3.1-HPV6b L1免疫小鼠后在血清內(nèi)測到了L1抗體，抗體滴度在1：100以上。而空載體及陰性對(duì)照組均未檢測到。用L1蛋白刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞只在pcDNA3.1-HPV6b L1免疫組出現(xiàn)了IL-4水平的明顯升高及IL-2、IFN-γ的微量升高，空載體及陰性對(duì)照組均未見升高。