O型口蹄疫病毒VP1重組蛋白的表達(dá)及其免疫原性的研究.pdf

1、口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是偶蹄動物共患的一種急性，熱性，高度接觸性傳染病，被國際獸疫局(OIE)列為A類疾病?？谔阋邆鞑パ杆?，給各國的帶來了經(jīng)濟(jì)上和政治上很大的經(jīng)濟(jì)損失。我國目前通過接種滅活苗疫苗的方法來控制該病的流行，滅活疫苗雖然具有完整的免疫原性和良好的保護(hù)效果，但存在病毒滅活不徹底甚至活毒逃逸等不安全因素。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，多種新型疫苗因?yàn)榘踩煽浚菀走M(jìn)行質(zhì)量控制等優(yōu)點(diǎn)吸引了更多研究人

2、員的注意。其中，重組蛋白疫苗只含有完整病毒的有效的免疫結(jié)構(gòu)，在刺激保護(hù)免疫的同時(shí)還保證了安全性，同時(shí)其生產(chǎn)制備手段已非常成熟，生產(chǎn)成本低廉，因而是獸用疫苗的最佳發(fā)展方向。 口蹄疫的病原為口蹄疫病毒(foot-and-mouth diseaLse virus，F(xiàn)MDV)，口蹄疫病毒共有7種血清型：A，O，C，Asial，SATI，SAT2和SAT3，型內(nèi)又分若干亞型?？谔阋卟《疽職び?種蛋白即VPl，VP2，VP3和VP4各60個(gè)

3、拷貝組成，其中VPl，VP2和VP3組成衣殼蛋白亞單位，VP4位于病毒顆粒內(nèi)部。VPl蛋白是FMDV主要的抗原，它含有的G-H環(huán)包含B細(xì)胞抗原表位141-160aa及200-213aa，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的免疫表位，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答，因此是研究口蹄疫疫苗的理想抗原。本實(shí)驗(yàn)選取FMDVO/TAW/97株結(jié)構(gòu)蛋白VPl上141-160aa及200-213aa的序列，合成兩拷貝141-160aa-200-213aa串聯(lián)片段(2V

4、Pl)，通過PCR擴(kuò)增另兩拷貝的片段，構(gòu)建含四拷貝141-160aa-200-213aa串聯(lián)片段(4VPl)的原核表達(dá)載體pET32a-4VPl，理想的疫苗不僅應(yīng)包含B細(xì)胞表位還應(yīng)包含T細(xì)胞表位，因?yàn)榇吮砦黄蝺H含有B細(xì)胞表位，缺少T細(xì)胞表位，不能刺激機(jī)體產(chǎn)生T細(xì)胞免疫應(yīng)答，因此本實(shí)驗(yàn)選取合成了含乙肝表面抗原(HBsAg)和破傷風(fēng)類毒素(Tr)的串聯(lián)片段的T細(xì)胞表位，并且插入了4VPl和2VPl的N端，克隆至原核表達(dá)載體pET32a(+

5、)，構(gòu)建融合型表達(dá)載體pET32a-TCE-4VPl及pET32a-TCE-2VPl，將構(gòu)建好的三個(gè)表達(dá)質(zhì)粒pET32a-4VPl、pET32a-TCE-4VPl及pET32a-TCE-2VPl轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，選擇最適的誘導(dǎo)條件。結(jié)果表明，構(gòu)建的三種表達(dá)載體經(jīng)過酶切鑒定和測序，證實(shí)其插入的片斷大小、讀碼框架正確。所表達(dá)的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，相對分子量分別約為38.5kDa、43.5kDa和34.6

6、kDa，重組菌體在LB中經(jīng)37℃、0.1mM IPTG、誘導(dǎo)4h即可使目的蛋白達(dá)到最大量誘導(dǎo)，重組菌經(jīng)超聲波破碎后，經(jīng)SDS-PAGE顯示部分在上清中表達(dá)，部分以包涵體形式表達(dá)，上清和包涵體復(fù)性后經(jīng)通過鎳親和層析得到純化的融合蛋白4VPl、TCE-4VPl及TCE-2VPl，經(jīng)Western-blotting鑒定融合蛋白具有良好的免疫學(xué)活性，為研究重組蛋白的免疫原性奠定了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)選取常用O型口蹄疫滅活苗免疫ICR小鼠，制備陽性血清，

7、共免疫3次，每次間隔2周。陰陽性血清用于建立ELISA方法，并且以小鼠的陽性血清作為一抗用于表達(dá)蛋白的Western-blotting分析。以人工合成O/FMDV/TAIWAN97株結(jié)構(gòu)蛋白VPl上141-160aa的20肽作為包被原，確定了包被96孔ELISA板的最佳濃度為5μg/mL，10％FCS、37℃封閉2h，被檢測血清的最佳稀釋度為1:200，一抗反應(yīng)時(shí)間為37℃、1h，二抗反應(yīng)時(shí)間為37℃、45min，選用TMB為底物，顯色

8、時(shí)間為15min，用2M H2SO4為終止液，為檢測血清中抗重組蛋白的抗體奠定了基礎(chǔ)。利用純化的3種融合蛋白以lOOμg/只免疫16-22g清潔級小鼠，并免疫一組表達(dá)TCE-2VPl的重組菌體，以常用O型FMDV滅活苗作為陽性對照，PBS作為陰性對照。，共免疫三次，每次間隔2周，每次免疫前采血，用建立的間接ELISA方法檢測3次免疫后2周的小鼠血清中抗20肽抗體，被檢血清1:100倍稀釋之后做倍比稀釋，結(jié)果表明三種融合蛋白均能刺激小鼠產(chǎn)