槲皮素-HO-1-膽紅素系統(tǒng)對大鼠原代肝細(xì)胞酒精性損傷的保護(hù)作用.pdf

1、研究背景：
　　 隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，酒精性肝病(alcoholic liverdisease，ALD)的發(fā)病率呈逐漸增高之勢，成為僅次于病毒性肝炎的第二大類肝病，其預(yù)防和治療也一直是世界性的重要公共衛(wèi)生問題。ALD的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，其中以氧化損傷與炎性應(yīng)激學(xué)說備受關(guān)注。近來越來越多研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素作為食物來源廣泛的黃酮類化合物，具有顯著的抗氧化、抗炎、抗凋亡等生物學(xué)效應(yīng)，對ALD 也具有明顯的保護(hù)效應(yīng)。進(jìn)

2、一步的研究表明，槲皮素對ALD的保護(hù)作用與其通過誘導(dǎo)肝臟I 型血紅素氧合酶(heme oxygenase-1，HO-1)而進(jìn)一步放大其抗氧化活性有關(guān)。
　　 然而，作為HO-1 催化血紅素分解的代謝產(chǎn)物之一的膽紅素，曾長期被認(rèn)為是機(jī)體有毒的代謝產(chǎn)物。只是近年來，隨著研究的深入，學(xué)者們才發(fā)現(xiàn)正常生理濃度的膽紅素也具有良好的抗氧化、抗炎、抗凋亡等生物活性。但膽紅素是否參與或介導(dǎo)HO-1 對肝細(xì)胞酒精性損傷的保護(hù)作用，目前尚無直接相關(guān)

3、的研究報(bào)道。
　　 因此，探討HO-1 代謝產(chǎn)物膽紅素對酒精所致肝細(xì)胞氧化損傷與炎性應(yīng)激的保護(hù)作用，不僅可進(jìn)一步完善槲皮素/HO-1 拮抗酒精性肝損傷的相關(guān)作用機(jī)制，還可更好地拓展人們對膽紅素的認(rèn)識。
　　 目的：
　　 1.探討槲皮素誘導(dǎo)HO-1 生成的膽紅素對乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞氧化損傷的潛在保護(hù)作用及其劑量效應(yīng)關(guān)系，并探討膽紅素對乙醇誘導(dǎo)氧化應(yīng)激所觸發(fā)的細(xì)胞凋亡是否具有拮抗效應(yīng)；
　　 2.分析膽紅素對

4、肝細(xì)胞氧化、炎性雙重應(yīng)激的潛在保護(hù)作用。
　　 方法：
　　 1．二步膠原酶灌注消化分離培養(yǎng)大鼠原代肝細(xì)胞，給以無水乙醇(200mmol/L，24h)誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化損傷，同時(shí)單獨(dú)或聯(lián)合給以槲皮素(100 μmol/L)、Hemin(血紅素，HO-1 誘導(dǎo)劑，20 μmol/L)、鋅原卟啉-IX(ZnPP-IX，HO-1 抑制劑，10 μmol/L)及不同劑量的外源性膽紅素(2、10、25、100 μmol/L)，觀察細(xì)胞

5、AST、LDH 酶的漏出、SOD 酶活性、GSH 水平、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA與ROS的產(chǎn)生及內(nèi)源性直接膽紅素水平，并檢測細(xì)胞線粒體膜電位、細(xì)胞凋亡率的變化。
　　 2．在大鼠原代肝細(xì)胞經(jīng)乙醇孵育(200 mmol/L)的同時(shí)，加入外源性的炎癥因子(TNF-α<5ng/ml>+IL-6＜2 ng/ml>)誘導(dǎo)細(xì)胞氧化與炎性雙重應(yīng)激，再加入膽紅素干預(yù)，觀察上述氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化，分析膽紅素對肝細(xì)胞酒精性氧化損傷基礎(chǔ)上疊加炎性應(yīng)激

6、時(shí)的保護(hù)作用。
　　 結(jié)果：
　　 1．槲皮素對乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞AST與LDH 酶的漏出、細(xì)胞GSH與SOD的消耗、MDA與ROS的產(chǎn)生對均有明顯的抑制作用，并且提高了內(nèi)源性膽紅素水平；血紅素表現(xiàn)了與槲皮素類似的效應(yīng)；而HO-1 抑制劑ZnPP-IX 則明顯抑制了槲皮素的上述保護(hù)效應(yīng)。
　　 2．中劑量的外源性膽紅素(25μmol/L、10 μmol/L)對乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞AST與LDH 酶的漏出、GSH與SOD

7、的消耗及MDA與ROS的產(chǎn)生也有明顯的抑制作用，而低劑量的膽紅素(2 μmol/L)則無明顯的保護(hù)作用，高劑量的膽紅素(100μmol/L)不僅本身表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性，而且加重了乙醇的細(xì)胞毒性。
　　 3．槲皮素有效拮抗乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體膜電位下降、并降低了細(xì)胞凋亡率，血紅素表現(xiàn)出與槲皮素類似的效應(yīng)，而ZnPP-IX 則明顯抑制了槲皮素的上述保護(hù)效應(yīng)。細(xì)胞經(jīng)乙醇孵育的同時(shí)給以外源性膽紅素(25μmol/L)，也有效維持了線粒

8、體膜電位水平且降低了細(xì)胞凋亡率。
　　 4．外源性炎癥因子與乙醇共同處理肝細(xì)胞時(shí)，加重了乙醇誘導(dǎo)的AST與LDH酶的漏出、GSH與SOD的消耗及MDA與ROS的產(chǎn)生。氧化、炎性雙重應(yīng)激時(shí)，外源性膽紅素(25μmol/L)對細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化具有明顯的抑制作用。
　　 結(jié)論：
　　 槲皮素誘導(dǎo)HO-1 可抑制肝細(xì)胞酒精性氧化損傷和炎性應(yīng)激，并且還能有效拮抗酒精所致的線粒體膜電位下降和細(xì)胞凋亡。此外，作為HO