新型肝細(xì)胞刺激因子Hepatopoietin Cn對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、氧化應(yīng)激是酒精造成肝臟損傷的重要途徑，緩解酒精引起的肝細(xì)胞氧化應(yīng)激對(duì)酒精性肝病的預(yù)防和治療具有重要意義。HPPCn(Hepatoooietin Cn，HPPCn)是本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的一種新型肝細(xì)胞刺激因子，它能夠特異性的促進(jìn)肝臟再生和肝源細(xì)胞系的增殖，并對(duì)CCl4造成的大鼠肝纖維化具有治療作用。本文擬研究其對(duì)酒精引起的肝臟氧化應(yīng)激的影響及其作用機(jī)制。
　　 我們通過工程菌BL21(DE3)/pET-24a(+)-HPPCn高密度發(fā)酵

2、生產(chǎn)重組人HPPCn蛋白(rhHPPCn)。發(fā)酵過程采用溶氧反饋調(diào)節(jié)，IPTG(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，共得菌體干重約480 g，包涵體形式表達(dá)的rhHPPCn51 g。包涵體蛋白經(jīng)過變性和復(fù)性后進(jìn)行Q-XL陰離子交換層析，得到純化的蛋白共19.2 g。我們利用AdEasyTM系統(tǒng)構(gòu)建了攜帶HPPCn基因的重組腺病毒Ad-SP-HPPCn，為使表達(dá)HPPCn蛋白分

3、泌到胞外，我們利用重組PCR技術(shù)在HPPCn基因上游添加了信號(hào)肽序列。經(jīng)過HEK293細(xì)胞擴(kuò)增和CsCl密度梯度超高速離心純化，病毒滴度達(dá)到1.6×1011 pfu/ml。
　　 我們以人正常肝細(xì)胞系L02為研究對(duì)象，考察rhHPPCn對(duì)酒精引起的肝細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，100 mM乙醇作用12h可引起L02細(xì)胞損傷，細(xì)胞谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶 GOT(glutamic oxaloacetic transaminase，G

4、OT)釋放明顯升高，細(xì)胞內(nèi)活性氧簇ROS(reactive oxygen species，ROS)過量積累，細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶SOD(superoxide dismutase，SOD)活力降低，還原型谷胱甘肽GSH(reduced glutathione hormone，GSH)含量減少。而提前給予rhHPPCn能顯著緩解乙醇引起的肝細(xì)胞損傷，細(xì)胞GOT釋放減少，細(xì)胞SOD和GSH維持在正常水平，rhHPPCn提高了細(xì)胞清除ROS的能

5、力，使細(xì)胞氧化應(yīng)激減輕。另外，rhHPPCn還能夠激活L02細(xì)胞中ERK和SPK兩條保護(hù)性信號(hào)通路，提示其可能通過這兩條通路發(fā)揮保護(hù)肝細(xì)胞，減輕氧化應(yīng)激的作用。
　　 利用昆明小鼠酒精灌胃模型進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，急性酒精攝入造成小鼠肝臟出現(xiàn)明顯病理改變，血清中谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶GPT(glutamate-pyruvatetransaminase，GPT)含量升高，血清和肝臟中甘油三酯TG(triglyeride，TG)增加，肝臟